Luận án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích kháng lên sự tích lũy Eurycomanone trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây bách bệnh (Eurycoma longifolia JACK)

ột số hoạt tính sinh học như 
làm tăng sản xuất testosterone ở tinh hoàn chuột, hoạt tính chống thấm 
(antiulcer activity), gây độc các dòng tế bào ung thư và kháng sốt rét [71]. 
Bằng các phương pháp sắc ký, Đoàn Mạnh Dũng và cs (2018) đã phân 
lập được hợp chất eurycomanone từ cây bách bệnh (E. longifolia J.). Cấu trúc 
của hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ 1H-NMR, 13C-
NMR và ESI-MS (electrospray ionization-mass spectrometry - Ion hóa tia 
điện-khối phổ). Hợp chất này được tinh sạch (độ tinh khiết trên 99,5%) bằng 
hệ thống sắc ký lỏng điều chế, và được sử dụng để làm chất chuẩn để phân 
tích hàm lượng eurycomanone trong các mẫu dược liệu bách bệnh bằng sắc 
ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS-liquid chromatography- mass 
spectrometry). Các tác giả đã xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ 
thống LC-MS/MS như sau: pha tĩnh cột sắc ký EC-C18 (100 × 2,1 mm; 2,7 
μm), pha động: ACN (acetonitrile) (A) – nước chứa 0,1% HCOOH (B) trong 
thời gian 5 phút với tỉ lệ tăng từ 15% đến 60% A, tốc độ dòng 0,3 mL/phút, 
thể tích tiêm mẫu: 1 μL; nhiệt độ buồng cột: 35 °C; dung môi pha mẫu: 
MeOH:H2O là 70:30 (v/v). Điều kiện khối phổ bao gồm nguồn ion hóa ESI, 
loại ion dương, nhiệt độ nguồn ion hóa là 300°C, chế độ chạy MRM với ion 
sơ cấp m/z 409,1 và ion thứ cấp là m/z 391,0. Kết quả cho thấy hàm lượng 
eurycomanone cao nhất khi thu hái ở Bắc Giang (3,1336 ± 0,0005 mg/g), thấp 
nhất ở Đắk Nông (0,1716 ± 0,0001 mg/g). Hợp chất eurycomanone là thành 
phần hoạt chất chính và được coi là chất đặc trưng của bách bệnh nói riêng và 
các loài Eurycoma nói chung [1]. 
Phân tích HPLC các sản phẩm dược liệu ở Malaysia cho thấy 
eurycomanone xuất hiện trong 58,9% các sản phẩm dược liệu, hàm lượng 
eurycomanone trong cây bách bệnh khoảng 0,8-1,5% (w/v) [18]. 
 40 
1.4.2. Sản xuất eurycomanone bằng nuôi cấy mô tế bào 
Nuôi cấy rễ tơ cây bách bệnh đã được phát triển bằng cách sử dụng vi 
khuẩn Agrobacterium rhizogenes để sản xuất hóa chất có nguồn gốc từ cây 
này. Ảnh hưởng của ba chất kích kháng: methyl jasmonate, salicylic acid và 
dịch chiết nấm men ở các nồng độ khác nhau đã được đánh giá ảnh hưởng đến 
việc sản xuất 9-methoxycanthin-6-one trong rễ tơ. Các mẫu nuôi cấy được tạo 
ra ở giai đoạn đầu tăng trưởng theo cấp số nhân, tiếp theo là quá trình chiết 
xuất 9-methoxycanthin-6-one bằng cách sử dụng methanol kết hợp phương 
pháp HPLC. Kích kháng với methyl jasmonate ở tất cả các nồng độ làm tăng 
9-methoxycanthin-6-one lên 1-3 lần và xử lý với nồng độ 0,1 mM cho hiệu 
quả nhất trong việc tăng cường sản xuất 9-methoxycanthin-6-one, đạt đến 
3.902 mg/g khối lượng khô sau 7 ngày (168 giờ) kích kháng [16]. 
Phan Tường Lộc và cs (2020) đã nghiên cứu tạo rễ tơ có khả năng sinh 
trưởng mạnh và tổng hợp eurycomanone cao nhằm tạo ra nguồn vật liệu in 
vitro có chất lượng ổn định. Hai dòng rễ tơ R1, R2 chọn lọc được có khả năng 
tăng trưởng mạnh, với mức nhân sinh khối trong 2 tuần lần lượt là 16; 15,5 
(g/g, khối lượng tươi) trên môi trường SH lỏng với 3% sucrose. Các dòng rễ 
này có nhiều tiềm năng để được tiếp tục nghiên cứu các điêu kiện nuôi cấy tối 
ưu cho việc sản xuất sinh khối sử dụng hoạt chất [6]. 
 41 
Chương 2 
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 
 Đối tượng nghiên cứu là callus được cảm ứng từ rễ cây bách bệnh 
(Eurycoma longifolia Jack) in vitro trong nghiên cứu của TS. Võ Châu Tuấn. 
Hạt của cây bách bệnh thu thập tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam được 
nuôi cấy tạo cây in vitro, sau đó rễ của cây in vitro 8 tuần tuổi được sử dụng 
để cảm ứng tạo callus. Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô 
và tế bào thực vật, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học 
Đà Nẵng. 
Hình 2.1. Cây bách bệnh 3 năm tuổi (bên trái) và 2 năm tuổi (bên phải) [84] 
Hình 2.2. Callus cây bách bệnh sau 14 ngày nuôi cấy 
 42 
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm 
2.2.1. Môi trường và điều kiện nuôi cấy ban đầu 
Môi trường dùng để nuôi cấy là môi trường MS cơ bản (Murashige and 
Skoog, 1962) [99] có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) khác 
nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm. Môi trường nuôi cấy có nguồn 
carbon là sucrose 3%, được làm đặc bằng agar 0,8%, pH được điều chỉnh đến 
5,8 sau đó được khử trùng ở 1210C (1 atm) trong 20 phút. 
Callus 
cây bách bệnh 
Khảo sát sự sinh trưởng và tích lũy Eur 
- Xác định loại và nồng độ chất ĐHST (2,4D, NAA, KIN) 
- Xác định hàm lượng Eur 
Nuôi cấy huyền phù tế bào 
- Xác định đường cong sinh trưởng 
- Xác định đường cong tích lũy Eur 
Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi 
cấy lên sự sinh trưởng và tích lũy Eur 
- Khảo sát nguồn carbon 
- Khảo sát giá trị pH 
Xử lý chất kích kháng 
- Khảo sát nồng độ chất kích kháng và 
thời gian kích kháng (SA, MeJ, YE) 
Phân tích hàm lượng Eur 
 43 
Mẫu thí nghiệm được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL 
chứa 50 mL môi trường, đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ ổn định (25 ± 
20C), cường độ chiếu sáng 2.000-3.000 lux và thời gian chiếu sáng 8-10 
giờ/ngày, ngoại trừ nuôi cấy tế bào là 500 lux. 
2.2.2. Nuôi cấy callus cây bách bệnh 
 Callus (3 g) được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung các chất 
điều hòa sinh trưởng là 2,4-D, NAA và KIN (kinetin) ở các nồng độ khác 
nhau để khảo sát khả năng tăng sinh của callus cây bách bệnh. 
 Các chất ĐHST được pha với dung môi thích hợp và bổ sung vào môi 
trường nuôi cấy trước khi khử trùng. 
 Sau 2 tuần nuôi cấy (14 ngày), callus được thu nhận, loại bỏ nước bám 
bên ngoài callus bằng phương pháp lọc (giấy lọc Whatman No.1) và xác định 
khối lượng tươi. Sau đó callus được sấy đến khi khối lượng không đổi ở nhiệt 
độ 50oC, để xác định khối lượng khô [13], [75]. 
 Chỉ số sinh trưởng (GI-growth index) của tế bào được xác định bởi 
công thức: 
𝐺𝐼 =
𝑊14
𝑊0
Trong đó: W14 và W0 là khối lượng tươi của tế bào tại thời điểm đánh 
giá và thời điểm bắt đầu nuôi cấy. 
2.2.3. Nuôi cấy huyền phù tế bào cây bách bệnh 
Sau khi đánh giá được môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng của 
callus, 3 g callus 14 ngày tuổi (tương đương 1,7 g callus sau khi lọc chân 
không) có màu vàng nhạt, rời, từ môi trường rắn được nuôi cấy lỏng trong 
bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường để nuôi cấy tế bào 
 44 
huyền phù. Công thức môi trường cho callus sinh trưởng tốt nhất được sử 
dụng để nuôi cấy huyền phù tế bào. Quá trình nuôi cấy được thực hiện với tốc 
độ lắc 120 vòng/phút. 
Sinh khối tế bào được thu sau mỗi 2 ngày nuôi cấy cho đến 20 ngày để 
xây dựng đường cong sinh trưởng và đường cong tích lũy eurycomanone của 
tế bào. 
Xây dựng đường cong sinh trưởng: tế bào được lọc và rửa sạch môi 
trường với nước cất bằng hệ thống lọc chân không, cân để xác định khối 
lượng tươi, sau đó, tế bào được sấy ở 50oC đến khối lượng không đổi, cân để 
xác định khối lượng khô, số liệu thu được dùng để xây dựng đường cong sinh 
trưởng của tế bào. 
Xây dựng đường cong tích lũy: dịch chiết methanol của sinh khối khô 
tế bào (mục 2.2.7) được phân tích HPLC để xác định hàm lượng 
eurycomanone (mục 2.2.8). Số liệu thu được dùng để xây dựng đường cong 
tích lũy của tế bào. 
2.2.4. Xác định sự ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng và 
tích lũy eurycomanone của huyền phù tế bào cây bách bệnh 
Sau khi xác định được thời gian tích lũy sinh khối và eurycomanone tối 
ưu, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau lên khả 
năng sinh trưởng và tích lũy eurycomanone của tế bào. 
Các nguồn carbon: sucrose, fructose và glucose được bổ sung riêng lẻ 
vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào ở các nồng độ khác nhau (mỗi 
nguồn carbon sử dụng 3 mức nồng độ: 20, 30 và 40 g/L). Sau thời gian nuôi 
cấy nhất định (đã xác định ở mục 2.2.3), sinh khối tế bào được thu hoạch để 
xác định khối lượng tươi, khối lượng khô và hàm hàm lượng eurycomanone 
tích lũy được. 
 45 
2.2.5. Xác định sự ảnh hưởng của pH môi trường lên sự sinh trưởng và 
tích lũy eurycomanone của huyền phù tế bào cây bách bệnh 
Để khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và tích lũy 
eurycomanone của tế bào, sử dụng môi trường nuôi cấy với nguồn carbon 
thích hợp nhất (đã xác định ở mục 2.2.4) cho sự sinh trưởng và tích lũy, điều 
chỉnh giá trị pH của môi trường từ 4,75 đến 6,75 trước khi khử trùng, khoảng 
chênh lệch pH giữa các môi trường là 0,5. 
Sau 14 ngày nuôi cấy, sinh khối tế bào được thu hoạch để xác định khối 
lượng tươi, khối lượng khô và hàm lượng eurycomanone tích lũy được. 
2.2.6. Xử lý chất kích kháng 
Chuẩn bị chất kích kháng 
Các chất kích kháng YE, MeJA (95%) và SA (99%) được cung cấp bởi 
hãng Merck (Đức). Sau khi pha dung dịch mẹ, dung dịch YE được hấp khử 
trùng, dung dịch MeJA và SA được lọc qua màng lọc 0,025 trước khi bổ 
sung vào môi trường nuôi cấy. 
Xác định ảnh hưởng của nồng độ chất kích kháng lên sự sinh trưởng và tích 
lũy eurycomanone của huyền phù tế bào cây bách bệnh 
Ảnh hưởng của nồng độ các chất kích kháng được đánh giá bằng cách 
bổ sung riêng lẻ YE, MeJA và SA vào môi trường (có nguồn carbon và pH 
đã xác định ở mục 2.2.4 và 2.2.5) với các nồng độ khác nhau tại thời điểm bắt 
đầu nuôi cấy (thời điểm kích kháng là 0 ngày). Trong đó, SA và MeJA có 
nồng độ từ 0,01-1 mM, YE từ 20-250 mg/L [16], [82], [83]. Đối chứng là 
công thức không bổ sung chất kích kháng (đã xác định ở mục 2.2.5). Sau thời 
gian nuôi cấy nhất định (được xác định ở mục 2.2.3), sinh khối tế bào được 
thu hoạch để xác định khối lượng tươi, khối lượng khô và hàm lượng 
eurycomanone. 
 46 
Xác định ảnh hưởng của thời điểm kích kháng lên sự sinh trưởng và tích lũy 
eurycomanone của huyền phù tế bào cây bách bệnh 
Nồng độ của chất kích kháng cho huyền phù tế bào cây bách bệnh sinh 
trưởng và tích lũy tốt nhất (đã xác định ở trên) được lựa chọn để đánh giá 
thời điểm kích kháng tối ưu. Chất kích kháng được bổ sung vào môi trường ở 
thời điểm từ 2 – 12 ngày nuôi cấy (mỗi công thức thí nghiệm cách nhau 2 
ngày). Đối chứng là công thức bổ sung chất kích kháng tại thời điểm ban đầu 
(đã xác định ở trên). Sau thời gian nuôi cấy nhất định (đã xác định ở mục 
2.2.3), tế bào được thu hoạch để xác định khối lượng tươi, khối lượng khô và 
hàm lượng eurycomanone. 
2.2.7. Chiết xuất eurycomanone 
Eurycomanone được chiết xuất theo phương pháp của Mohamad và cs 
(2013) [91] có điều chỉnh để phù hợp với điều kiện cụ thể của phòng thí 
nghiệm. Sinh khối khô của tế bào (callus, huyền phù tế bào, rễ cây tự nhiên) 
được nghiền thành bột mịn, sau đó chiết bằng cách ngâm 0,5 g mẫu trong 10 
mL methanol (Merck), lắc 120 vòng/phút ở 600C trong 8 giờ, sau đó để lắng 
và thu dịch chiết. Quy trình chiết được lặp lại 3 lần. Dịch chiết (khoảng 30 
mL) được lọc qua giấy lọc Whatman (No.1) và cô đặc ở 500C. Sau đó, kết tủa 
được hòa tan trong methanol, lọc qua màng lọc Minisart 0,2 µm (Sartorius, 
Goettingen, Đức), để phân tích HPLC nhằm xác định hàm lượng 
eurycomanone. 
Mẫu callus và huyền phù tế bào được thu hoạch ở các thí nghiệm, mẫu 
rễ cây khoảng 5 năm tuổi được thu thập ngoài tự nhiên tại huyện Đại Lộc, 
tỉnh Quảng Nam (tuổi của cây được xác định tương đối bằng cách phỏng vấn 
người dân). 
 47 
2.2.8. Phân tích HPLC 
Hàm lượng eurycomanone được xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu 
năng cao (HPLC) theo phương pháp của Norhidayah và cs (2015) [108] có 
điều chỉnh phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. 20 µL dịch chiết được 
tiêm vào máy HPLC bằng Hamilton syringe. Điều kiện chạy HPLC ở nhiệt độ 
phòng, cột C18 (Xbridge: 5 µm, 4,6 x 250 mm), tốc độ chạy: 0,8 mL/phút, 
thời gian chạy: 17,5 phút, detector đọc ở bước sóng 245 nm, pha tĩnh là silica 
gel và pha động là acetonitrile: H2O (15:85). 
Quy trình phân tích HPLC được thực hiện trên máy LC-20 Prominence 
(Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản), với SPD-20A UV-VIS detector, sử dụng phần 
mềm LC-Solution. Các hóa chất sử dụng để phân tích HPLC được cung cấp 
bởi hãng Merck & Co.Inc. (Darmstadt, Đức). Đường chuẩn của 
eurycomanone được sử dụng để xác định hàm lượng eurycomanone chứa 
trong mẫu phân tích. 
Eurycomanone của hãng Santa Cruz (CA, Mỹ) được dùng làm chất 
chuẩn để xác định hàm lượng eurycomanone. Hàm lượng eurycomanone 
được xác định dựa theo đường chuẩn được xây dựng từ diện tích peak của các 
nồng độ eurycomanone chuẩn khác nhau trong phân tích HPLC, phương trình 
đường chuẩn là y = 3504672,8353x + 6163,5917 (R2 = 0,9984), trong đó x là 
hàm lượng eurycomanone, y là diện tích peak HPLC (Đường chuẩn 
eurycomanone được trình bày ở phần Phụ lục). 
2.2.9. Xử lý thống kê 
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 
lần, mỗi lần gồm 5 bình nuôi cấy. Trong thí nghiệm nuôi cấy callus, mỗi bình 
nuôi cấy từ 8-10 mẫu. 
Kết quả thí nghiệm được tính trung bình và phân tích ANOVA bằng 
Duncan’s test với p<0,05 sử dụng phần mềm SPSS ver 20.0./. 
 48 
Chương 3 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN KHẢ 
NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CALLUS 
 Theo các tài liệu đã công bố, callus cây bách bệnh thường sinh trưởng 
tốt trên các môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4-D, NAA và KIN [60], 
[103], [126]. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát khả năng phối 
hợp của các chất này lên sự tích lũy sinh khối của callus cây bách bệnh, trong 
đó, các chất 2,4-D, NAA được sử dụng riêng rẽ hay kết hợp với KIN. 
3.1.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng riêng lẻ 
 Khoảng 3 g callus được cấy lên môi trường MS có bổ sung các chất 
ĐHST với các nồng độ khác nhau, sau 2 tuần nuôi cấy callus được thu, xác 
định khối lượng tươi và khô để đánh giá khả năng sinh trưởng của callus. 
Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng (2,4-D, NAA 
và KIN) lên khả năng sinh trưởng của callus cây bách bệnh được trình bày ở 
các bảng 3.1, 3.2 và 3.3). 
3.1.1.1. Ảnh hưởng của 2,4-D 
Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng sinh trưởng 
của callus cây bách bệnh được trình bày ở bảng 3.1. Qua bảng 3.1 cho thấy 
khi nuôi cấy callus lên môi trường chỉ có 2,4-D, ở tất cả các nồng độ khảo sát 
callus đều sinh trưởng tốt, chỉ số sinh trưởng đạt trên 2, khối lượng tươi đạt 
6,56-7,56 g/bình (tương ứng với khối lượng khô đạt 0,36-0,55 g/bình). Trong 
đó, công thức bổ sung 2 mg/L 2,4-D cho kết quả tốt nhất, chỉ số sinh trưởng 
của callus đạt 2,52, khối lượng tươi và khô lần lượt là 7,56 và 0,55 g/bình, 
callus có màu vàng đậm, rắn và rời rạc. 
 49 
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng sinh trưởng của callus 
2,4-D 
(mg/L) 
Khối lượng 
tươi (g) 
Khối lượng 
khô (g) 
Chỉ số sinh 
trưởng (GI) 
Hình thái callus 
0,5 6,56b 0,36b 2,19 Vàng nhạt, mọng nước 
1,0 6,84ab 0,39b 2,28 Vàng đậm, rắn, rời rạc 
1,5 7,47a 0,48ab 2,49 Vàng đậm, mọng nước 
2,0 7,56a 0,55a 2,52 Vàng đậm, mọng nước 
2,5 7,41a 0,42b 2,47 Vàng đậm, mọng nước 
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa 
thống kê của các trung bình mẫu với p<0,05 (Duncan’s test). Chú thích này dùng 
chung cho tất cả các bảng. 
3.1.1.2. Ảnh hưởng của NAA 
Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA lên khả năng sinh trưởng 
của callus cây bách bệnh được trình bày ở bảng 3.2. 
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng sinh trưởng của callus cây bách bệnh 
NAA 
(mg/L) 
Khối lượng 
tươi (g) 
Khối lượng 
khô (g) 
Chỉ số sinh 
trưởng (GI) 
Hình thái callus 
0,50 20,47d 0,79c 6,8 Vàng nhạt, mọng nước 
0,75 21,92b 0,88b 7,3 Vàng nhạt, mọng nước 
1,00 21,30c 0,87b 7,1 Vàng đậm, rắn, rời rạc 
1,25 23,59a 0,93a 7,8 Vàng đậm, rắn, rời rạc 
1,50 18,50e 0,72d 6,2 Vàng đậm, rắn, rời rạc 
1,75 18,21e 0,71d 6,1 Vàng đậm, rắn, rời rạc 
2,00 17,24f 0,65e 5,7 Vàng nhạt, mọng nước 
2,25 16,79f 0,62f 5,6 Vàng nhạt, mọng nước 
Qua bảng 3.2 cho thấy NAA cho hiệu quả cao nhất ở nồng độ 1,25 
mg/L, sinh khối callus từ 3 g nuôi cấy ban đầu đạt đến 23,59 g tươi (tương 
 50 
ứng với 0,93 g khô) với chỉ số sinh trưởng (GI) là 7,8, callus có màu vàng 
đậm, rắn, rời rạc (Hình 3.1 A). Trong khi đó, sinh khối tích luỹ thấp trên môi 
trường nuôi cấy có bổ sung từ 2-2,25 mg/L NAA, sinh khối tươi đạt lần lượt 
là 17,24 và 16,79 g (tương ứng với 0,65 và 0,62 g khô), callus có màu vàng 
nhạt và mọng nước (Hình 3.1 B). 
Hình 3.1. Callus sinh trưởng trên môi trường có 1,25 mg/L NAA (A) và 2,25 mg/L 
NAA (B) sau 14 ngày nuôi cấy. 
3.1.2. Ảnh hưởng của kết hợp các chất ĐHST 
Trong nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST riêng lẻ, 
chúng tôi nhận thấy sử dụng NAA có hiệu quả hơn so với 2,4-D, vì thế chúng 
tôi sử dụng NAA trong thí nghiệm kết hợp với KIN. 
Kết quả kết hợp giữa 1,25 mg/L NAA với các nồng độ khác nhau của 
KIN (0,50-2,00 mg/L, mỗi công thức chênh nhau 0,25 mg) được trình bày ở 
bảng 3.3. Kết quả cho thấy sinh khối callus đạt cao nhất (30,98-32,34 g 
tươi/bình, tương ứng với 1,26-1,31 g khô/bình) thu nhận từ môi trường MS 
chứa 0,75 – 1,00 mg/L KIN, GI đạt tương ứng là 10,3-10,7. Kết quả này 
chứng tỏ rằng bổ sung NAA kết hợp với KIN thúc đẩy hơn nữa việc sinh 
trưởng của callus khi so sánh với bổ sung riêng từng chất ĐHST. 
 51 
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của NAA và KIN đến khả năng sinh trưởng của callus cây 
bách bệnh 
NAA 
(mg/L) 
KIN 
(mg/L) 
Khối lượng 
tươi (g) 
Khối lượng 
khô (g) 
Chỉ số sinh 
trưởng (GI) 
Hình thái callus 
1,25 
0,50 23,43c 0,92c 7,8 Vàng nhạt, mọng nước 
0,75 30,98ab 1,26a 10,3 Vàng nhạt, mọng nước 
1,00 32,34a 1,31a 10,7 Vàng đậm, rắn, rời rạc 
1,25 28,80b 1,11b 9,6 Vàng đậm, rắn, rời rạc 
1,50 24,65c 0,94c 8,2 Vàng đậm, rắn, rời rạc 
1,75 20,49d 0,79d 6,8 Vàng nhạt, mọng nước 
2,00 18,70d 0,78d 6,2 Vàng nhạt, mọng nước 
3.1.3. Sự tích lũy eurycomanone trong callus cây bách bệnh 
 Kết quả phân tích HPLC mẫu dịch chiết từ callus 14 ngày tuổi trên môi 
trường nuôi cấy tốt nhất (MS cơ bản có bổ sung 1,25 mg/L NAA và 1,00 
mg/L KIN) và rễ cây bách bệnh tự nhiên khoảng 5 năm tuổi cho thấy tất cả 
các mẫu đều xuất hiện 1 peak có thời gian lưu giống với chất chuẩn 
eurycomanone (khoảng 4,15 phút). Hàm lượng eurycomanone trong callus là 
0,17 mg/g chất khô (bằng khoảng 8% so với mẫu rễ cây tự nhiên là 2,09 
mg/g) (Hình 3.2). Như vậy, có thể khẳng định có sự sinh tổng hợp 
eurycomanone trong callus cây bách bệnh, đây là cơ sở để tiến hành các 
nghiên cứu nuôi cấy tế bào huyền phù cây bách bệnh nhằm sản xuất 
eurycomanone sau này. 
 52 
Hình 3.2. Phổ HPLC phân tích hàm lượng eurycomanone trong callus. 
A. Eurycomanone chuẩn (Diện tích peak (S): 366964), B. Dịch chiết callus 14 ngày 
tuổi của cây bách bệnh (S: 340054), C. Dịch chiết rễ cây bách bệnh khoảng 5 năm 
tuổi trồng trong điều kiện tự nhiên (S: 645974). 
A 
B 
C 
 53 
 Tóm lại, môi trường cơ bản MS có bổ sung 1,25 mg/L NAA và 1,00 
mg/L KIN cho hiệu quả tốt nhất, callus sinh trưởng mạnh với chỉ số sinh 
trưởng đạt 10,07, khối lượng tươi lên tới 32,34 g/bình, tương ứng với khối 
lượng khô là 1,31 g/bình. Hàm lượng eurycomanone trong callus là 0,17 mg/g 
chất khô, bằng khoảng 8% so với mẫu rễ cây tự nhiên khoảng 5 năm tuổi. 
3.2. THIẾT LẬP NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng và ứng dụng lâu 
dài trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các chất dùng trong y 
học. Hướng nghiên cứu này sẽ dẫn đến sự ổn định về mặt chất lượng và số 
lượng sản phẩm, ít phụ thuộc vào tự nhiên. Đồng thời, là nguồn nguyên liệu 
cho những thí nghiệm sinh lý, hóa sinh và ứng dụng để tách chiết các hợp 
chất thứ cấp khác nhau [5]. Các nghiên cứu cho thấy rằng, nuôi cấy tế bào 
thực vật có khả năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so 
với các chất đó được chiết từ cây ngoài tự nhiên [78]. Ưu điểm của chúng là 
có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy. 
3.2.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng và tích lũy eurycomanone 
Trong nghiên cứu này, tế bào cây bách bệnh được nuô