Luận án Nghiên cứu biểu hiện gen GmDREB6 nhằm nâng cao khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen

 
2.1.1. Vật liệu 
Hạt của giống đậu tương ĐT22 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển 
Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm cung cấp. Hạt đậu tương 
được gieo trồng tại vườn thí nghiệm khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm 
Thái Nguyên để thu hạt làm nguyên liệu chuyển gen (Hình 2.1). 
Hình 2.1. Hình ảnh của một số giai đoạn phát triển ở giống đậu tương ĐT22 
được sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen 
A, B: Giai đoạn ra hoa; C: Giai đoạn quả chắc; D: Rễ cây đậu tương giai 
đoạn ra hoa; E: quả 3 hạt; G: Hạt đậu tương (Ảnh chụp của tác giả). 
47 
Giống ĐT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ 
dòng đột biến của hạt lai (DT95 x ĐT12). Thời gian sinh trưởng của cây trung 
bình 85- 90 ngày. Chiều cao cây đạt từ 45- 70 cm và chống đổ tốt. Giống 
ĐT22 có hoa màu trắng, phân cành trung bình, số quả chắc trung bình đạt từ 
25- 45 quả/cây, có khoảng 16- 20% số quả có 3 hạt. Hạt màu vàng sáng, rốn 
hạt màu nâu đậm, nâu đen. Khối lượng 1000 hạt dao động từ 155- 160g, thời 
gian sinh trưởng trung bình 85- 90 ngày. Giống có thể trồng được 3 vụ trong 
năm, chống chịu đất ướt và nhiễm bệnh mức nhẹ đến trung bình đối với một 
số bệnh hại chính, giống ĐT22 kháng bệnh phấn trắng. Giống ĐT22 sinh 
trưởng, phát triển tốt trên đất phù xa, cát pha, đất màu, đất sau lúa mùa ở các 
tỉnh phía Bắc, Duyên Hải Nam trung bộ như Hà Nội, Hà Nam, Thái Bình, 
Vĩnh phúc, Cao bằng, Sơn La, Bắc Cạn, Điện biên Năng suất trung bình từ 
18-27 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh. Giống đậu tương 
ĐT22 được đánh giá có khả năng chịu mặn thấp [1], do vậy giống ĐT22 được 
chọn làm vật liệu nghiên cứu chuyển gen GmDREB6. 
Cây thuốc lá (Nicotinana tabacum) giống K326 được sử dụng làm cây 
mô hình để phân tích hoạt động và biểu hiện của cấu trúc mang gen chuyển 
GmDREB6. Giống K326 là giống thuốc lá được Công ty Novatis lai tạo tờ tổ 
hợp lai Mc Nair 225 (coker 139 x coker 319) x (NC nair 30 x NC 95), sản 
xuất và đưa ra từ năm 1982, ở trên thế giới giống này đang được trồng rất phổ 
biến. Giống này có ưu điểm lớn nhất là sinh trưởng tốt và ra hoa sớm. Giống 
K326 được nuôi cấy in vitro và lưu giữ tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế 
bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái 
Nguyên. 
Chủng Agrobacterium tumefaciens AGL1 được lưu giữ tại Phòng thí 
nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, 
Đại học Thái Nguyên. 
48 
2.1.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 
Môi trường cơ bản MS có bổ sung vitamin B5 [85], các chất điều hòa 
sinh trưởng như Benzyl amino purine (BAP), Indol - 3 - butiric acid (IBA)...; 
kháng sinh kanamycin, cefotaxim; Các hóa chất khác như yeast extract, bacto 
pepton, trypton, NaCl, agar, sucrose, glycerol, acetosyringone, L- cystein, 
Na2S2O3 phosphinothricin được cung cấp bởi các hãng, như New England 
Biolabs (Anh), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals (Đức), 
Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Merck (Đức) và Wako (Nhật Bản), bột MS 
(BioWorld, USA). 
Các loại Kit được sử dụng trong thao tác phân tử được mua từ các hãng 
Fermentas, Bio-Neer như: Kit Trizol Reagents – tách chiết RNA tổng số; kit 
Maxima® First Strand cDNA Synthesis – tổng hợp cDNA; kit Gene JEP PCR 
Purification – tinh sạch sản phẩm PCR; kit Plasmid Extraction – tách chiết 
plasmid từ vi khuẩn. 
Tủ cấy, máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di 
Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-
Rad, Mỹ), máy Voltex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy xung điện 
Plulser, máy xác định hàm lượng nucleic acid Nano Drop, cùng với các thiết 
bị hiện đại khác. 
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.2.1. Nhóm phương pháp phân tích phân họ gen DREB ở đậu tương 
Phân tích phân họ gen DREB ở đậu tương được thực hiện bằng công cụ 
Tin sinh học. Dữ liệu trình tự gen GmDREB và vùng AP2 của protein DREB 
được khai thác từ Ngân hàng dữ liệu NCBI [152], trong đó có các trình tự gen 
GmDREB1, GmDREB2, GmDREB5, GmDREB6 được phân lập từ các giống 
đậu tương Việt Nam [153], [154]. 
49 
Xác định các gen DREB trong hệ gen đậu tương 
Các protein thành viên phân họ DREB chỉ chứa một miền AP2, do vậy 
xác định các thành viên của phân họ gen DREB trong hệ gen đậu tương được 
tra cứu trên Ngân hàng dữ liệu gen NCBI [152], kết hợp kiểm tra vùng AP2 
của protein DREB trên cơ sở dữ liệu họ protein Pfam. 
Phân tích phát sinh phân họ gen DREB ở đậu tương 
Phân tích phát sinh chủng loại phân tử thực hiện bằng phần mềm 
MEGAX theo phương pháp Maximum Likelihood và mô hình Tamura-Nei 
[65] với bootstrap được lặp lại 1000 lần [119]. Các trình tự gen DREB đã xác 
định được phân tích bằng ClustalW và một cây phát sinh được thiết lập thể 
hiện sự tiến hóa của phân họ gen DREB ở đậu tương. 
Phân tích phát sinh miền AP2 trong phân họ protein DREB ở đậu tương 
Lịch sử tiến hóa của miền AP2 trong phân họ nhân tố phiên mã DREB 
ở đậu tương được suy luận theo phương pháp Maximum Likelihood và mô 
hình JTT matrix-based [58] với bootstrap được lặp lại 1000 lần trong 
MEGAX [65]. Trình tự amnio acid của miền AP2 được phân tích bằng 
ClustalW và sơ đồ cây được thiết lập dựa trên 69 trình tự amino acid của miền 
AP2 [65]. 
2.2.2. Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật và phân 
tích hoạt động của vector biển hiện gen GmDREB6 trên cây thuốc lá 
2.2.2.1. Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen chuyển GmDREB6 và tạo 
vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp 
Vector chuyển gen mang gen GmDREB6 được thiết kế theo hai bước 
cơ bản: (1) Thiết kế cấu trúc độc lập bao gồm gen GmDREB6, đoạn cmyc và 
vị trí cắt của cặp enzyme Xbal/ Sacl (GmDREB6_cmyc); (2) Chèn cấu trúc 
50 
vào vector chuyển gen thực vật pBI121 để tạo thành vector tái tổ hợp 
pBI121_GmDREB6. 
Vector tái tổ hợp được chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng xung 
điện (2,5 kV, 25 μF, 200 Ω) để tạo ra vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp. 
Dòng vi khuẩn cho sản phẩm colony-PCR được nuôi trong LB lỏng, giữ 
chủng trong LB đặc và dùng cho lây nhiễm trong chuyển gen. 
2.2.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm 
Vi khuẩn A.tumefaciens mang gen chuyển GmDREB6 được nuôi chọn 
lọc trong 15ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/l và 
rifamycin 50 mg/l ở 28oC lắc 200 rpm, 48 giờ. Chuyển 10ml dịch huyền phù tế 
bào trên vào 50 ml LB lỏng không kháng sinh để nuôi phục hồi 28oC, lắc 200 
rpm đến khi OD600nm = 0,8 là đạt số lượng tế bào tối ưu để biến nạp. Ly tâm 
toàn bộ dịch tế bào ở 4oC, 5000 rpm, 15 phút. Hoà tan tế bào lắng vào 40ml 
dung dịch ½MS + AS 50 μl đặt trong nước đá lạnh. 
Bảng 2.1.Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 
Môi trường Thành phần 
LB lỏng Bacto pepton 10 g/l + Nacl 10 g/l + Yeast Extract 5 g/l, pH = 7 
LB đặc LB lỏng + agar 16g/l 
2.2.2.3. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens vào thuốc lá 
Biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 thông qua A.tumefaciens vào 
giống thuốc lá K326 được thực hiện theo phương pháp của Topping (1998) 
[131]. Lá cây thuốc lá được cắt thành từng mảnh mô có kích thước 1,0 x 1,0 
cm, ngâm các mảnh lá trong dung dịch huyền phù tế bào vi khuẩn 
51 
A.tumefaciens tái tổ hợp trong thời gian 10 phút. Sau khi nhiễm khuẩn, các 
mẫu biến nạp được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy và tái sinh in vitro 
(Bảng 2.2). 
Bảng 2.2. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá chuyển gen 
Hỗn hợp Thành phần môi trường 
Stock I KNO3 1,9 g + KH2PO4 0,17 g + NH4NO3 1,65 g + MgSO4 0,37 g 
(Thể tích: 1000 ml) 
Stock II CaCl2 0,44 g (Thể tích: 1000 ml) 
Stock III H3BO3 6,2 mg + MnSO4.4H2O 22,3 mg + CoCl2.6H2O 0,025 mg 
+ CuSO4.7H2O 0,025 mg + ZnSO4.7H2O 8,6 mg + 
Na2MoO4.2H2O 0,25 mg + KI 0,83 mg (Thể tích: 1000 ml) 
Stock IV FeSO4 27,8 mg + Na2EDTA 37,3 mg (Thể tích: 1000 ml) 
Stock V Myo-Inositol 100 mg + Thiamine HCl 0,1 mg + Pyridoxine HCl 
0,5 mg + Nicotic acid 0,5 mg + Glycine 2 mg (Thể tích: 1000 ml) 
MS 20 ml/l stock I + 10 ml/l stock (II, III, IV, V) 
½MS 10 ml/l stock I + 5 ml/l stock (II, III, IV, V) 
Môi 
trường tái 
sinh chồi 
MS + BAP 1,0 mg/l + sucrose 30 g/l + agar 9 g/l + kanamycin 50 
mg/l + cefotaxime 500 mg/l 
Môi 
trường ra 
rễ 
MS + IBA 0,5 mg/l + MES 1.0 g/l + sucrose 30 g/l + agar 9 g/l+ 
nước dừa 100 ml/l + kanamycin 50 mg/l + cefotaxime 500 mg/l 
* Ghi chú: Môi trường MS ở dạng dung dịch. Các môi trường đều được 
chuẩn pH = 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 2oC, 
thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ ngày. 
52 
Các mẫu sau lây nhiễm được đồng nuôi cấy trong tối 2 ngày, sau đó 
mẫu được rửa sạch khuẩn bằng cefotaxime 500 mg/ml và được thấm khô trên 
giấy thấm khử trùng. Các mẫu tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường tái sinh 
tạo đa chồi (môi trường MS có bổ sung BAP và kanamycin để chọn lọc cây 
chuyển gen), các mẫu được đều đặn cấy chuyển sang môi trường mới sau 
khoảng hai tuần. Các chồi sống sót được chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ 
sung kanamycin. Các cây con được huấn luyện và trồng trong nhà lưới. 
2.2.2.4. Phương pháp xác định sự có mặt của gen chuyển GmDREB6 trong 
cây thuốc lá chuyển gen 
DNA tổng số tách chiết từ lá cây thuốc lá chuyển gen và cây WT theo 
phương pháp của Saghai-Maroof và cs (1984) [107]. Sự có mặt và sự phiên 
mã của gen chuyển GmDREB6 trong cây thuốc lá chuyển gen được xác định 
bằng phản ứng PCR với cặp mồi XbaI-DREB6-F/ DREB6-SacI-R (Bảng 2.3). 
Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR sử dụng để xác định sự 
có mặt của gen chuyển GmDREB6 trong cây thuốc lá chuyển gen 
Tên mồi Trình tự nucleotide (5’ – 3’) 
Nhiệt độ 
tiếp hợp 
mồi (°C) 
Kích 
thước 
XbaI-DREB6-
F/ 
 DREB6-
SacI-R 
ATGAAGTTCAACCAACCACTTCA
T 
58 741 bp 
ATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG
T 
Thành phần của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.4. Chu trình 
nhiệt của phản ứng PCR gen GmDREB6 là 94˚C/3 phút 30 giây; (94˚C/30 
53 
giây; 58˚C/50 giây; 72˚C/1 phút 20 giây) lặp lại 30 chu kỳ; 72˚C/10 phút; 
4˚C: ∞. 
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR 
Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 
Nước deion - 8,5 
Master mix 2 X 12,5 
Primer ( F+ R) 10 pmol/𝜇l 2,0 
DNA/cDNA 100 ng/𝜇l 2,0 
Tổng thể tích 25 
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di 
trên gel agarose 1% và nhuộm bằng EtBr, sau 10 phút tiến hành chụp ảnh 
dưới ánh sáng cực tím và phân tích kết quả. 
Sự hợp nhất của gen chuyển GmDREB6 vào hệ gen của cây thuốc lá 
chuyển gen được xác định bằng kỹ thuật phân tích Southern blot (1975) 
[126]. Trình tự DNA của mẫu dò được đánh dấu bằng Biotin DNA 
DecaLabel, sử dụng biotin-11-dUTP. Gen GmDREB6 được khuếch đại bằng 
cách sử dụng PCR với cặp mồi XbaI-DREB6-F/ DREB6SacI-R. Các mẫu 
DNA tổng số từ cây thuốc lá chuyển gen dương tính với PCR ở thế hệ T0 
được cắt bằng enzyme giới hạn SacI ở 37°C. Các phân đoạn DNA thu được 
được kiểm tra, đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel agarose và sau đó 
các đoạn DNA được chuyển từ gel điện di sang màng lai và thực hiện lai với 
DNA mẫu dò. Màng được lai ở 44°C. Kết quả lai được hiển thị trên phim X-
quang. 
54 
2.2.2.5. Phương pháp tách chiết RNA tổng số 
RNA tổng số được tách từ lá cây chuyển gene bằng Trizol™ Reagent 
(Invitrogen) [155]. 
cDNA được tổng hợp từ RNA bằng bộ Kit tổng hợp cDNA Maxima® 
First Strand (Fermantas). Các bước thực hiện: 
(1) Nghiền mịn mẫu lá của các dòng cây thuốc lá, đậu tương trong nitơ lỏng, 
lấy 300 mg bột mẫu vào eppendorf 2ml đã khử DEPC. 
(2) Bổ sung 1ml Trizol, trộn đều mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút. 
(3) Bổ sung 1ml hỗn hợp chloroform: isoamylalcohol (24:1), lắc mạnh trong 
15 giây, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút. 
(4) Li tâm 13000vòng/phút trong 10 phút, hút 600𝜇l dịch phía trên chuyển 
sang Eppendorf 1,5ml đã khử DEPC. 
(5) Bổ sung 500 μl isopropanol, lắc nhẹ, đặt mẫu trong tủ -20oC trong 30 
phút để tủa RNA. Li tâm 13000vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn. 
(6) Bổ sung 500 μl cồn 70o để rửa. Li tâm 13000vòng/phút trong 10 phút, bỏ 
dịch thu cặn (bước này thực hiện 2 lần). 
(7) Làm khô mẫu trong box bật quạt 5 phút, hòa tan cặn bằng 50 μl nước khử 
ion có DEPC và DNase, bảo quản mẫu ở -86oC. 
2.2.2.6. Xác định sự phiên mã của gen chuyển GmDREB6 trong cây chuyển 
gen 
 Sự biểu hiện của gen GmDREB6 ở mức phiên mã được phân tích bằng 
phản ứng RT-PCR với cặp mồi XbaI-DREB6-F/DREB6-SacI-R. Phản ứng 
RT-PCR được thực hiện qua hai giai đoạn: 
55 
(1) Giai đoạn RT: Đây là giai đoạn tổng hợp cDNA từ mRNA. Phản ứng 
được thực hiện theo hướng dẫn của hãng sản xuất Fermentas. Tổng hợp 
cDNA từ 1,5 µg RNA theo hướng dẫn của bộ kit RevertAid First Strand 
cDNA Synthesis Kit [156]. 
Bước 1: Trộn hỗn hợp gồm 3𝜇l RNA, 1µl mồi Oligo(dT)18, 8𝜇l nước khử ion 
khử DEPC, li tâm nhanh mẫu, ủ ở 65oC trong 5 phút. 
Bước 2: Bổ sung 2 μl dung dịch đệm cho enzyme phiên mã ngược, 1µl dNTPs, 
1µl Inhibitor, li tâm nhanh mẫu, đặt mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 
Bước 3: Bổ sung 1μl reverse transcriptase. Sau đó đặt mẫu vào máy PCR với 
chu trình nhiệt 42oC trong 1 giờ và 70oC trong 10 phút. 
(2) Giai đoạn PCR: cDNA được sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen 
GmDREB6. Thành phần của phản ứng được trình bày trong bảng 2.3. Chu 
trình nhiệt cho phản ứng PCR gen GmDREB6 là 94˚C/3 phút 30 giây; 
(94˚C/30 giây; 58˚C/50 giây; 72˚C/1 phút 20 giây) lặp lại 30 chu kỳ; 72˚C/10 
phút; 4˚C: ∞. 
2.2.3 Nhóm phương pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen 
GmDREB6, NtP5CS, NtCLC trên cây thuốc lá chuyển gen 
2.2.3.1. Phương pháp xử lý và phân tích khả năng chịu mặn của cây chuyển 
gen 
Thí nghiệm được thực hiện trong phòng nuôi cấy với nhiệt độ duy trì ở 
mức 25°C và độ ẩm 80% với chu kỳ sáng và tối là 16h/ 20h. Cây thuốc lá 
kiểu dại (WT) và chuyển gen GmDREB6 in vitro được huấn luyện và đưa ra 
trồng trong chậu có kích thước 115 x 85 x 105 mm chứa hỗn hợp phân trộn 
Tribat, bao gồm đất hữu cơ, đất phù sa, hỗn hợp xốp, than hoạt tính và vi sinh 
vật. Các cây thí nghiệm được tưới 50 ml NaCl 200 mM hàng ngày trong 3 
56 
tuần. Các cây đối chứng được tưới với lượng H2O bằng nhau. Các mẫu lá 
được thu thập vào ngày cuối cùng của thí nghiệm để phân tích biểu hiện gen. 
2.2.3.2. Phương pháp phân tích sự biểu hiện gen bằng phản ứng Real time 
quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) 
Các cặp mồi của gen tham chiếu Actin và gen đích GmDREB6 được 
thiết kế và tổng hợp theo đơn đặt hàng với Công ty Phù Sa (Việt Nam) để sử 
dụng cho phản ứng qRT-PCR nhằm phân tích mức độ phiên mã và hoạt động 
của cấu trúc vector chuyển gen trong cây chuyển gen. 
Phản ứng qRT- PCR được thực hiện với thể tích 20 µl gồm các thành 
phần như sau: 10 µl SYBR Premix Ex Taq II; 0,75 μl của mồi xuôi (F) 10 
mM; 0,75 µl sơn ngược (R) 10 mM; 7,5 µl nước khử ion không có DNase và 
1,0 μl cDNA. Thông tin về các mồi được sử dụng trong phản ứng qRT-PCR 
được trình bày ở bảng 2.5. 
57 
Bảng 2.5. Trình tự nucleotide của các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng 
Realtime RT-PCR 
Tên mồi Trình tự nucleotide (5'-3') 
Nhiệt độ 
tiếp hợp 
mồi (°C) 
GmDREB6-F/ 
GmDREB6-R 
ATGGTCATGGAAGAATCTAACCCA 58 
TTAATTATGATTCCCATAGA 58 
ActNF/ ActNR 
GATCTTGCTGGTCGTGATCTT 58 
GTCTCCAACTCTTGCTCATAGTC 60 
qRT-DREB-F/ 
qRT-DREB6-R 
TAATGAAGGCAAGCACCCTAC 60 
CGTCGGCTAATTCTGGGAAA 60 
qRT-P5CS-F/ 
qRT-P5CS-R 
TGCTCGTGAGATGGCAGTTGC 60 
AGCCTGTTGAGCAGCAACCAC 60 
qRT-CLC-F/ 
qRT-CLC-R 
CTTGGAGGCCTTCTCGGAAGC 60 
AGCCTACAGGACATGGTGTGC 60 
Chu trình nhiệt của phản ứng qRT-PCR như sau: 95°C trong 3 phút, 
thực hiện khuếch đại trong 40 chu kỳ (95°C trong 10 giây, tiếp hợp mồi ở 
60°C trong 20 giây và kéo dài ở 72°C trong 20 giây). Các phản ứng được lặp 
lại 3 lần. Kết quả được tổng hợp và phân tích bằng phần mềm Q-Rex phiên 
bản 1.0.0 (QIAGEN, Đức), và phương pháp Livak’s -ΔΔ Ct của Livak được 
sử dụng để phân tích dữ liệu biểu hiện gen [76]. 
58 
2.2.4. Nhóm phương pháp chuyển gen GmDREB6 vào cây đậu tương 
2.2.4.1. Phương pháp biến nạp cấu trúc vector mang gen chuyển 
GmDREB6 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua A. tumefaciens 
Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens lây nhiễm qua 
nách lá mầm được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Olhoft và cs (2006) [97] 
và Nguyễn Thu Hiền và cs (2014) [3]. Quy trình cụ thể như sau: 
Tạo nguyên liệu biến nạp: Hạt đậu tương sau khi khử trùng bằng khí 
clo từ hỗn hợp 100 ml javen + 3 ml HCl đậm đặc được nuôi cấy và nảy mầm 
trên môi trường RM (Bảng 2.6). Sau 5 ngày, lá mầm được tách đôi và loại bỏ 
đỉnh sinh trưởng để sử dụng làm nguyên liệu nhận gen và nuôi cấy in vitro. 
Vi khuẩn A.tumefaciens chứa vector chuyển gen pBI121_GmDREB6 
được nuôi trong môi trường LB lỏng có kháng sinh chọn lọc, sau đó nuôi 
phục hồi trong LB lỏng không kháng sinh, li tâm thu dịch. Tạo dịch huyền 
phù A.tumefaciens trong môi trường ½ MS. 
Thành phần của các môi trường được dùng trong nghiên cứu này như 
môi trường mầm, đồng nuôi cấy, cảm ứng tạo chồi, kéo dài chồi và tạo cây 
đậu tương chuyển gen in vitro hoàn chỉnh ở giống đậu tương ĐT22 được thể 
hiện ở bảng 2.6. Các môi trường đều sử dụng MS cơ bản là chế phẩm pha sẵn 
ở dạng bột hỗn hợp có đầy đủ dinh dưỡng, khoáng cần thiết. 
Lây nhiễm và đồng nuôi cấy: Gây tổn thương các mảnh lá mầm đậu 
tương bằng mũi dao và kim nhọn ở phần nách lá mầm. Các mảnh lá mầm đã 
tổn thương được ngâm trong dịch huyền phù A. tumefaciens mang vector 
pBI121_GmDREB6 trong thời gian 30 phút. Sau đó, các mẫu biến nạp được 
chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc, không kháng sinh. Quá 
trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong thời gian 3 ngày. 
59 
Bảng 2.6. Môi trường nảy mầm, đồng nuôi cấy, cảm ứng tạo chồi, tái sinh 
cây chuyển gen ở giống đậu tương ĐT22 
Môi trường Thành phần 
Hạt nảy mầm 
(germination 
medium -GM) 
MS 4,3 g/l + Muối B5 3,052 g/l + sucrose 20 g/l + gellan 
2,5 g/l, pH = 5,8 có bổ sung vitamin B5 1000X 1ml/l. 
Đồng nuôi cấy 
(co-cultivation 
medium- CCM) 
MS 4,3 g/l + Muối B5 0,316g/l + MES 3,9 g/l + Sucrose 
30 g/l + agar 6 g/l có bổ sung acetosyringone 0,04 g/l + 
vitamin B5 1000X 1ml/l + BAP 1,67 mg/l + GA3 
0,25mg/l, pH = 5,4. 
Tạo đa chồi 
(shoot 
induction 
medium-SIM) 
MS 4,3g/l + Muối B5 3,052g/l + MES 0,59g/l + sucrose 
30 g/l + agar 8g/l, pH = 5,8, bổ sung BAP 1,67 mg/l + 
cefotaxim 500mg/l + vitamin B5 1000X 1ml/l + 
kanamycin 50 mg/l (lần 1) và kanamycin 75 mg/l (lần 2). 
Kéo dài chồi 
(shoot 
elongation 
medium-SEM) 
MS 4,3 g/l + MES 0,59g/l + sucrose 30 g/l + nước dừa 
200ml/l + gellan 2,5 g/l, pH = 5,8; bổ sung cefotaxim 
500mg/l + vitamin B5 1000X 1ml/l + GA3 500mg/l + 
IAA 100mg/l + L-asparagine monohydrate 50mg/l + 
kanamycin 50 mg/l. 
Ra rễ (rooting 
medium-RM) 
MS 4,3 g/l + sucrose 20 g/l + MES 0,59g/l + gellan 2,5 
g/l, pH = 5,8 có bổ sung cefotaxim 250mg/l + IBA 
0,1mg/l + vitamin B5 1000X 1ml/l + L-asparagine 
monohydrate 50mg/l + kanamycin 50 mg/l. 
Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM: Sau thời gian đồng nuôi cấy, 
mẫu biến nạp được rửa trong môi trường cảm ứng tạo chồi SIM, bổ sung 
cefotaxim 500 mg/l với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm 
khử trùng. Đặt mẫu lên môi trường tạo chồi SIM 1, bổ sung cefotaxim 500 
60 
mg/l và kanamycin 50 mg/l (lần 1). Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển 
sang môi trường SIM 2 đặc, bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 75 
mg/l (lần 2). 
Kéo dài chồi: Sau 3 tuần, các cụm chồi sống sót trên môi trường chọn 
lọc bằng kháng sinh được loại bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường phát triển 
kéo dài chồi (SEM), bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l. 
Tạo rễ và cây hoàn chỉnh: Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 – 
4cm sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ RM, bổ sung cefotaxim 250 mg/l 
và kanamycin 50 mg/l để tạo cây hoàn chỉnh. 
Cây ra giá thể: Những cây khoẻ mạnh, có bộ rễ phát triển được đưa ra 
bầu trên giá thể có tỷ lệ 2 đất thịt: 1 trấu hun : 2 sơ dừa. Sau khoảng 2 tuần, các 
cây sống sót được đưa trồng trong nhà lưới. 
2.2.4.2. Xác định sự có mặt và sự phiên mã của gen chuyển GmDREB6 
trong cây đậu tương chu