Luận án Nghiên cứu chế tạo bộ Kit Lamp chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (Strongyloides stercoralis) ở người 2017-2020

F3 285 305 21 
B3 510 489 22 
LF 316 336 21 
LB 488 465 24 
 Sản phẩm khuếch đại sau phản ứng LAMP bằng cặp mồi F3-B3 có kích 
thước theo lý thuyết là 226 bp < 250 bp. 
56 
Bảng 3.3 Khoảng cách giữa các mồi được thiết kế 
Khoảng cách Độ dài (bp) Yêu cầu 
Đầu 5’ của F2 đến đầu 5’ của B2 152 120 – 180 
Đầu 5’ của F2 đến đầu 3’ của F1 45 40 – 60 
Đầu 5’ của B2 đến đầu 3’ của B1 50 40 – 60 
Đầu 3’ của F3 đến đầu 5’ của F2 11 0 – 20 
Đầu 3’ của B3 đến đầu 5’ của B2 1 0 – 20 
Khoảng cách giữa các mồi đều thỏa mãn yêu cầu của hệ mồi. 
Bảng 3.4 Nhiệt độ nóng chảy và khả năng tạo bắt cặp dimer mồi (dG <- 
2,34) của bộ mồi xác định giun lươn đường ruột 
Tên mồi Nhiệt độ nóng chảy Tm 5'dG 3'dG Tỷ lệ GC 
F3 56,60 -5,53 -4,06 0,38 
B3 57,89 -5,04 -4,85 0,41 
FIP 
BIP 
LF 56,79 -4,43 -4,55 0,43 
LB 63,00 -7,64 -3,15 0,46 
- Về thành phần %GC, các mồi đều có %GC nằm trong tỉ lệ cho phép (38% - 
46%). 
- Nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi đều thỏa mãn điều kiện của mồi LAMP 
chuẩn. 
- Mức năng lượng tự do ở các đầu 3’ của các mồi F2/B2; F3/B3; LF/LB và 
đầu 5’của F1c/B1c được thiết kế có ∆G từ -7,64 đến -4,06 < -4Kcal/mol, đây 
là yêu cầu bắt buộc đối với một bộ mồi LAMP. 
57 
 Như vậy, bộ mồi chúng tôi thiết kế đáp ứng đủ các điều kiện đề ra của một 
hệ mồi LAMP. 
3.1.1.2 Khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi 
Tính đặc hiệu của bộ mồi được khảo sát bằng cả lý thuyết và thực nghiệm. 
Trên lý thuyết để khẳng định sản phẩm PCR khuếch đại bằng bộ mồi đúng 
là trình tự của loài Strongyloides stercoralis, chúng tôi sử dụng chương trình 
Primer Blast trên NCBI để kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi F3-B3. Kết quả 
thu được cho thấy, mồi bắt cặp hoàn toàn với trình tự 18S rRNA của 
Strongyloides stercoralis được công bố trên NCBI. 
Hình 3.4: Kết quả khảo nghiệm tính đặc hiệu trên ngân hàng gen 
58 
- Khảo sát bằng thực nghiệm: Kiểm tra phản ứng chéo của bộ mồi thiết 
kế 
Để kiểm tra phản ứng chéo của bộ mồi thiết kế, chúng tôi đã tiến hành 
các bước sau: 
+ Thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi F3/B3 với mẫu ADN của 
giun móc, giun mỏ, Gnathostoma sp 
+ Điện di kiểm tra sản phẩm nhân bản trên gel agarose. 
+ Kết quả đạt yêu cầu khi không có sản phẩm nhân bản của cặp mồi 
F3/B3 thiết kế với ADN của giun móc, giun mỏ, Gnathostoma sp 
Kết quả sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2% để kiểm tra sự 
bắt cặp của mồi trên gen 18S của từng loài. 
Hình 3.5: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi F3-B3 của Strongyloides 
stercoralis 
Làn 1-3: Strongyloides stercoralis 
Làn 4: Giun móc Ancylostoma duodenale 
Làn 5: Giun mỏ Necator americanus 
Làn 6: Gnathostoma sp 
Làn 7: Chứng âm 
59 
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi 
ADN Mồi F3-B3 
Giun lươn đường ruột + 
Giun móc - 
Giun mỏ - 
Gnathostoma sp - 
Từ kết quả điện di trên gel agarose 2% cho thấy chứng dương: có vạch 
sản phẩm với kích thước như dự kiến (226bp), không xuất hiện băng phụ và 
nhiệt độ biến tính đúng thiết kế. Chứng âm không có sản phẩm khuếch đại. 
Như vậy, kết quả này cho thấy không có sự bắt cặp chéo của cặp mồi với các 
loài khác, chứng tỏ mồi hoạt động tốt, thể hiện tính đặc hiệu của hệ mồi. 
3.1.2 Kết quả xác định các điều kiện phản ứng LAMP với bộ mồi tự thiết 
kế 
3.1.2.1 Nhiệt độ của phản ứng LAMP 
Một đặc điểm đặc trưng của LAMP là khuếch đại ADN hiệu quả trong 
điều kiện đẳng nhiệt với nhiệt độ phù hợp cho phản ứng có thể dao động từ 
50-68°C. Nhiệt độ mồi tính theo lý thuyết là nhiệt độ tham khảo, nhiệt độ bắt 
cặp thực sự có thể cao hơn 3-120C so với nhiệt tính toán. Trên cơ sở này, 
chúng tôi đã tiến hành khảo sát nhiệt độ trong khoảng từ 600C đến 650C, ngoại 
trừ sự thay đổi về nhiệt độ lai còn các thành phần khác (ADN bản mẫu, mồi, 
đệm phản ứng) và các điều kiện khác (điều kiện về thiết bị, thời gian phản 
ứng,) của phản ứng đều được giữ nguyên và đồng nhất, thí nghiệm được lặp 
lại 3 lần. Kết quả điện di sản phẩm LAMP cho thấy không có sự khác biệt 
giữa 3 điểm nhiệt độ khảo sát là 630C, 640C, 650C (Hình 3.6). 
Commented [BH1]: Em xem lại format tiêu đề của các bảng nhé 
60 
Hình 3.6 Sản phẩm LAMP khảo sát ở dải nhiệt độ 600C – 650C 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn điểm nhiệt độ trung bình là 
63°C cho phản ứng LAMP. Nhiệt độ 63°C được đánh giá là tạo điều kiện ủ 
mồi và tăng cường khả năng chịu đựng các chất ức chế thường được tìm thấy 
trong các mẫu chẩn đoán bệnh; một lợi thế polymerase khác. Đây cũng là 
nhiệt độ phù hợp nhất cho hoạt tính xúc tác của enzyme trong vi khuẩn so với 
Bacillus tự nhiên. Từ kết quả nghiên cứu này, nhiệt độ 63°C được lựa chọn để 
tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 
3.1.2.2 Nồng độ MgSO4 
Trong phản ứng LAMP, nồng độ MgSO4 thích hợp thường nằm trong 
khoảng 4mM đến 8mM. Khi tiến hành khảo sát nồng độ MgSO4, chúng tôi 
tiến hành các phản ứng ở cùng nhiệt độ lai 630C (nhiệt độ tối ưu từ thử 
nghiệm ở trên), thành phần các chất tham gia phản ứng là như nhau, chỉ khác 
biệt về nồng độ MgSO4: 4mM, 6mM và 8mM, thí nghiệm được lặp lại ba lần. 
Kết quả được đánh giá thông qua điện di sản phẩm trên gel agarose 2% (hình 
3.7A, B) 
61 
Hình 3.7.A: Sản phẩm LAMP ở nồng độ 8mM 
(Làn 1-8) và 6mM (Làn 10-16). 
Hình 3.7.B: Sản phẩm 
LAMP ở nồng độ 4mM 
Sau khảo sát, chúng tôi nhận thấy rằng, MgSO4
 ở nồng độ 4mM không 
có sản phẩm khuếch đại, MgSO4 ở nồng 6mM cho sản phẩm không ổn định, 
hiệu suất không cao, MgSO4
 ở nồng độ 8mM cho sản phẩm LAMP với hiệu 
suất khuếch đại cao và ổn định. Do vậy, chúng tôi chọn MgSO4 ở nồng độ 
8mM là nồng độ tối ưu cho phản ứng LAMP. 
3.1.2.3 Thời gian tiến hành phản ứng LAMP 
Tiến hành khảo sát thời gian tối thiểu thực hiện phản ứng LAMP ở các 
mức điều kiện thời gian 40 phút, 60 phút, trừ sự thay đổi về thời gian còn các 
thành phần (ADN khuôn, mồi, đệm phản ứng, nồng độ MgSO4 tối ưu từ thử 
nghiệm ở trên là 8mM) và các điều kiện khác (thiết bị) của phản ứng đều 
được giữ nguyên và đồng nhất, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả cho 
thấy thời gian tối thiểu để khuếch đại ADN trong phản ứng LAMP của bộ kit 
là 60 phút (hình 3.8). 
62 
Hình 3.8 Sản phẩm LAMP sau thời gian phản ứng 40 phút (Làn 1-8) và 60 
phút (Làn 9-16). 
3.1.2.4 Chất chỉ thị màu sử dụng để đọc kết quả LAMP. 
 Chất chỉ thị màu Xanh malachite (MG), ([C6H5C (C6H4N (CH3) 2) 2] 
Cl) đã được sử dụng thành công như là một chất chỉ thị nhạy với pH để phát 
hiện các sản phẩm LAMP. Sự thay đổi màu sắc của MG (dạng cation) phụ 
thuộc vào pH của dung dịch (pH 10: 
không màu). Bước sóng hấp thụ cho MG là 621nm. Trong xét nghiệm 
LAMP-MG, các mẫu dương tính và âm tính dễ dàng được phân biệt bằng mắt 
thường là màu xanh nhạt và không màu, tương ứng. 
Hình 3.9.A: Hình ảnh các ống trước 
phản ứng. 
Hình 3.9.B: Hình ảnh màu của các 
ống sau phản ứng: Mẫu dương có 
màu xanh nhạt; mẫu âm không 
màu 
63 
 Các nồng độ MG được khảo sát là 0,0012%, 0,008%, 0,004% và 
0,001%. Mỗi một nồng độ được tiến hành lặp lại 3 lần, kết quả được quan sát 
và ghi nhận bởi 3 người độc lập. 
Hình 3.10 Kết quả khảo sát nồng độ MG để đọc kết quả LAMP 
Bảng 3.6 Báo cáo quan sát chất chỉ thị màu MG ở các nồng độ khác nhau 
trong thử nghiệm LAMP. 
Nồng độ 
MG 
Mẫu Màu xanh lam % Dương 
tính 
% Âm 
tính Có Không 
0,001% Chứng dương 0 36* 0% 100% 
 Chứng âm 0 36 0% 100% 
0,004% Chứng dương 36 0 100% 0% 
 Chứng âm 0 36 0% 100% 
0,008% Chứng dương 36 0 100% 0% 
 Chứng âm 27 9 75% 25% 
0,012% Chứng dương 36 0 100% 100% 
 Chứng âm 31 5 86,1% 13,8% 
*: Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần, với 4 mẫu và được ghi nhận bởi 3 người quan sát 
độc lập. Tổng cộng ở mỗi nồng độ có 36 lần đọc. 
64 
 Kết quả cho thấy có sự tương đồng 100% giữa 3 người quan sát và 
kết luận nồng độ MG 0,004% là nồng độ tối ưu có thể phân biệt được các mẫu 
dương tính và âm tính. Nồng độ MG cao hơn dẫn đến sự gia tăng dương tính 
giả, Nồng độ MG thấp sẽ không thể phân biệt được mẫu âm và mẫu dương. 
Màu xanh lam ở các ống mẫu dương tính sau phản ứng vẫn còn nguyên màu 
cho đến tối đa 6 tuần, ở điều kiện nhiệt độ phòng. Thời gian sau 6 tuần không 
được nghiên cứu. Các thí nghiệm sau đó đã được thực hiện bằng cách sử dụng 
nồng độ cuối cùng là 0,004% MG. 
3.1.3 Ngưỡng phát hiện của bộ kit LAMP 
Ngưỡng phát hiện của kỹ thuật LAMP xác định giun lươn đường ruột 
được xác định bằng cách thực hiện phản ứng LAMP với nền mẫu là dãy nồng 
độ ADN pha loãng từ plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rRNA đặc trưng 
của Strongyloides stercoralis. Thử nghiệm được chia làm hai giai đoạn. 
Giai đoạn một: Thực hiện dò điểm giới hạn phát hiện sơ cấp bằng cách 
thực hiện phản ứng LAMP với dãy 6 nồng độ plasmid tái tổ hợp được pha 
loãng bậc 10 liên tiếp (từ 10-6ng/µl đến 10-11ng/µL). Nồng độ thấp nhất mà tại 
đó luôn có sản phẩm khuếch đại sau phản ứng LAMP chính là ngưỡng phát 
hiện sơ cấp cần tìm. 
Giai đoạn hai: Thực hiện dò ngưỡng phát hiện với độ tin cậy 95% 
(LOD95%) bằng cách thực hiện phản ứng LAMP với dãy nồng độ plasmid tái 
tổ hợp được pha loãng tiệm cận với nồng độ của ngưỡng phát hiện sơ cấp của 
giai đoạn 1. 
65 
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện sơ cấp của bộ mồi LAMP 
Nồng độ 
(ng/µL) 
Kết quả 
Lần 1 Lần 2 Lần 3 
10-6 (+) (+) (+) 
10-7 (+) (+) (+) 
10-8 (+) (+) (+) 
10-9 (-) (-) (-) 
10-10 (-) (-) (-) 
10-11 (-) (-) (-) 
Neg1 (-) (-) (-) 
Neg2 (-) (-) (-) 
Kết quả cho thấy, ngưỡng phát hiện sơ cấp của bộ mồi là 10-8 ng/µL tương 
ứng với 2,82x100 copies/ µL. 
66 
Kết quả được đánh giá bằng cách quan sát sự thay đổi màu dung dịch 
trong các ống sau phản ứng LAMP và điện di sản phẩm trên gel agarose 2%. 
Hình 3.11. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện của bộ mồi LAMP chẩn đoán 
giun lươn đường ruột. 
Ống 1: nồng độ ADN 10-6ng/µL. Ống 5: nồng độ ADN 10-10ng/µL. 
Ống 2: nồng độ ADN 10-7ng/µL. Ống 6: nồng độ ADN 10-11ng/µL 
Ống 3: nồng độ ADN 10-8ng/µL. Ống 7: Chứng âm 1 
Ống 4: nồng độ ADN 10-9ng/µL. Ống 8: chứng âm 2 
Hình ảnh chất chỉ thị màu và chất điện di cũng thể hiện ngưỡng phát hiện sơ 
cấp của bộ mồi là 10-8 ng/µL. 
67 
Bảng 3.8 Khảo sát ngưỡng phát hiện của bộ kit chẩn đoán giun lươn 
đường ruột 
TT Nồng độ 
(ng/μl) 
Số lượng 
bản sao 
(bản sao 
gen/μl) 
Số lần 
lặp lại 
Số lần 
dương 
tính 
Tỉ lệ dương 
tính 
(%) 
1 1x10-6 2,82x102 12 12 100,00 
2 1x10-7 2,82x101 12 12 100,00 
3 1x10-8 2,82x100 12 12 100,00 
4 7,5x10-9 2,12x100 12 11 91,67 
5 5 x 10-9 1,41x100 12 8 66,67 
6 2,5x10-9 7,05 x 10-1 12 6 50,00 
7 1,25x10-9 3,53x10-1 12 4 33,33 
8 1x10-9 2,82 x10-1 12 2 16,67 
9 6,25 x10-10 1,41 x10-1 12 1 8,33 
10 3,125x10-10 7,05x10-2 12 0 0,00 
11 0 0 12 0 0,00 
LOD95% của của bộ kit LAMP chẩn đoán GLĐR sau khảo sát là 
2,12x100 số bản sao gen/µL (95% CI:1,71x100 bản sao gen/μl đến 2,89 
x100bản sao gen/μl). Đây là ngưỡng phát hiện tốt, cho phép phát hiện tác 
nhân gây bệnh ở mật độ thấp. 
68 
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn LOD 95% của bộ kit LAMP chẩn đoán GLĐR. 
3.1.4 Kết quả xây dựng chứng dương 
3.1.4.1 Kết quản nhân bản đoạn gen đích chứa trình tự thiết kế mồi LAMP 
bằng phương pháp PCR 
Thực hiện PCR đơn với cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn trình tự đích 
bao chọn vùng trình tự thiết kế mồi LAMP sử dụng để xác định GLĐR trên 
gen 18S rRNA từ mẫu ADN chuẩn. Điện di để kiểm tra sản phẩm PCR trên 
gel agarose 1%. 
Hình 3.13. Sản phẩm PCR chứa trình tự gen đích Strongyloides stercoralis 
69 
Kết quả thu được đoạn gen đích có kích thước 226 bp đúng như kích thước 
thiết kế. 
Các băng ADN này được tiến hành tinh sạch và giải trình tự so sánh với 
gen 18S rRNA của Strongyloides stercoralis trên ngân hàng gen. Kết quả cho 
thấy có sự tương đồng 98% giữa hai trình tự này. Như vậy, sản phẩm PCR 
này có thể sử dụng để chuyển vào vector tách dòng. 
3.1.4.2 Kết quả biến nạp vector 
Sản phẩm PCR ở trên được tinh sạch (thôi gel), sau đó được chèn vào 
vector pUC19, sau đó hóa biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng DH5α™-T1R 
và nuôi cấy chọn lọc trên môi trường LB chứa kanamycin.
Hình 3.14. Plasmid tái tổ hợp mang gen 18S rRNA của giun lươn đường ruột. 
70 
Theo dõi khuẩn lạc mọc, lựa chọn khuẩn lạc trắng mọc riêng rẽ trên đĩa 
để xác định khả năng chứa plasmid tái tổ hợp. Thu nhận các khuẩn lạc mọc 
được trên đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin nồng độ 
cuối cùng là 50 µg/ml để tách DNA plasmid. Nhân kiểm tra plasmid bằng 
phản ứng PCR với cặp mồi M13 và giải trình tự, so sánh với ngân hàng gen 
có tỷ lệ tương đồng 98% chứng tỏ đoạn gen đích đã được chèn thành công. 
Đoạn trình tự bảo tồn trên gen 18S rRNA của giun lươn đường ruột có 
kích thước 596 bp được chèn vào vector pUC19 và nhân dòng. Kết quả chúng 
tôi thu được Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rRNA đặc trưng cho giun 
lươn đường ruột có kích thước 3282bp. Lượng Plasmid thu hồi là 5µg và hòa 
tan trong 50µL để thu được nồng độ 100ng/µL, tương đương với 2,82x1010 
copies/µL. 
3.1.5 Kết quả chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm S. stercoralis 
Chúng tôi đã chế tạo kit và đóng gói với số lượng là 2000 test ở quy mô 
phòng thí nghiệm để phục vụ cho hoạt động thử nghiệm và kiểm định. Bộ kit 
được đóng gói 50 phản ứng/bộ gồm: Tờ hướng dẫn sử dụng của bộ kit (Phụ 
lục 2) và 6 ống hóa chất với thành phần và số lượng cụ thể theo bảng sau 
71 
Bảng 3.9 Thành phần của bộ kít 
Số 
TT 
Thành phần 
(Dung dịch) 
Thể tích 
(50 phản ứng) 
Số lượng 
(ống) 
01 WT – 01 800 µL 01 
02 STE-MM – 02 650 µL 01 
03 STE-PM – 03 130 µL 01 
04 Bst-Taq – 04 52 µL 01 
05 MG – 05 50 µL 01 
06 STE-PC – 06 102 µL 01 
Ngoài hộp của bộ kit có nhãn với đầy đủ thông tin về lô sản xuất, ngày 
hết hạn, điều kiện bảo quản, nơi sản xuất. 
Hình 3.15 Hình ảnh bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột. 
72 
HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN BỘ KIT LAMP CHẨN 
ĐOÁN GIUN LƯƠN Strongyloises stercoralis. 
Nội dung của tờ hướng dẫn gồm những điểm chính sau: 
- Giới thiệu 
+ Nêu nguyên tắc của phương pháp LAMP chẩn đoán giun lươn đường 
ruột: Bộ Kít này dùng để phát hiện Strongyloides stercoralis bằng kỹ thuật 
khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian (LAMP - Loop Isothermal 
Median Amplification). Bộ Kit bao gồm các thành phần cơ bản của một phản 
ứng LAMP, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế trên vùng gen 18S 
rRNA của S. stercoralis để phát hiện loài này một cách chính xác với độ nhạy 
cao. 
+ Nền mẫu sử dụng của bộ kit là ADN tách chiết từ mẫu mô, mẫu phân 
hoặc mẫu nước tiểu. 
- Thành phần và quy cách đóng gói 
Nêu rõ cách đóng gói của bộ kit là 50 phản ứng/hộp và bộ kit gồm 6 hộp 
hóa chất được trình bày rõ về tên và số lượng tóm tắt trong một bảng 
- Hướng dẫn sử dụng: Bao gồm 4 tiểu mục nhỏ 
+ Chuẩn bị phản ứng LAMP: Nêu rõ các bước tiến hành phản ứng 
LAMP 
+ Điều kiện phản ứng LAMP: Nêu rõ điều kiện nhiệt và thời gian của 
phản ứng LAMP. 
+ Phiên giải kết quả: Nêu rõ cách đọc kết quả của bộ kit. 
+ Các tình huống phát sinh và cách xử lý: Nêu rõ các tình huống có thể 
xảy ra trong quá trình sử dụng bộ kit và cách xử lý. 
- Độ nhạy, độ đặc hiệu: Nêu rõ độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát 
hiện của bộ kit. Số lượng mẫu đã được sử dụng để đánh giá các chỉ số trên. 
73 
- Một số lưu ý: Nêu rõ một số điểm cần chú ý để đảm bảo sử dụng bộ kit 
hiệu quả và đảm bảo độ tin cậy kết quả. 
- Điều kiện bảo quản: Nêu rõ điều kiện bảo quản của bộ kit -200C ±5 
- Hạn dùng: Nêu rõ hạn dùng của bộ kit là 1 năm kể từ ngày sản xuất 
khi dung dịch chưa mở nắp và 06 tháng sau khi mở nắp. 
- Nơi sản xuất: Nêu rõ bộ kit là sản phẩm của đề tài cấp nhà nước với 
mã số KC10.16/16-20 và được sản xuất thử nghiệm tại Viện sốt rét - Ký sinh 
trùng - Côn trùng Trung ương 
- Tài liệu tham khảo: Nêu rõ các tài liệu tham khảo chính về nguyên lý 
của kỹ thuật LAMP dùng để chẩn đoán giun lươn Strongyloides stercoralis. 
3.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng 
thí nghiệm và thực địa 
3.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP tại phòng thí 
nghiệm 
Tiến hành đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu trên 132 mẫu phân thu thập tại 
tỉnh Long An và các mẫu thu từ ĐHYK Phạm Ngọc Thạch năm 2018. 
Bảng 3.10 Tóm lược kết quả xét nghiệm mẫu phân chẩn đoán GLĐR 
bằng các phương pháp soi phân trực tiếp và real-time PCR 
Soi phân trực tiếp 
Real-time PCR 
(+) (-) 
Dương tính 32 0 
Âm tính 0 100 
Tổng 32 100 
Xét nghiệm 132 mẫu phân thu thập tại tỉnh Long An và thu từ ĐHYK 
74 
Phạm Ngọc Thạch năm 2018 bằng các phương pháp soi phân trực tiếp, real-
time PCR cho kết quả như nhau gồm 32 mẫu dương tính và 100 mẫu âm tính 
(bảng 3.10 và phụ lục 3) 
Bảng 3.11 Tóm lược kết quả xét nghiệm mẫu phân chẩn đoán GLĐR 
bằng các phương pháp soi phân trực tiếp và LAMP. 
Soi phân trực tiếp 
LAMP 
(+) (-) 
Dương tính 31 1 
Âm tính 3 97 
Tổng 34 98 
Xét nghiệm chẩn đoán GLĐR 132 mẫu phân trên bằng phương pháp 
LAMP thì có kết quả là có 34 mẫu dương tính và 98 mẫu âm tính (bảng 3.11 
và phụ lục 3) 
Hình 3.16 Kết quả real-time PCR 
75 
Bảng 3.12 Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP chẩn đoán 
giun lươn đường ruột 
Kết quả kit 
LAMP 
Mẫu phân xét nghiệm Strongyloides 
stercoralis đã được xác định bằng qPCR Tổng 
Dương tính Âm tính 
Dương tính 31 3 34 
Âm tính 1 97 98 
Tổng số 32 100 132 
 Độ nhạy Se: 96,88% (95% CI: 83,78% - 99.92%) 
Độ đặc hiệu Sp: 97,00% (95% CI: 91,48% - 99,38%) 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tính toán độ nhạy, độ đặc 
hiệu của bộ kit LAMP so sánh với phương pháp qPCR làm phương pháp 
tham chiếu (chuẩn vàng). Kết quả ở bảng 3.12 thể hiện độ nhạy, độ đặc hiệu 
của bộ kit LAMP chẩn đoán GLĐR lần lượt là 96,88% và 97%. Như vậy bộ 
kit LAMP chẩn đoán GLĐR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, đáp ứng yêu cầu đối 
với một bộ kit xét nghiệm chẩn đoán. 
3.2.2 Điều kiện bảo quản và độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán 
giun lươn đường ruột 
Bộ kit đóng gói vào tháng 1/2019 và được bảo quản ở nhiệt độ -200C ± 
50C. Các mẫu sử dụng để đánh giá là 3 mẫu chuẩn dương ở nồng độ 10-
6ng/µL, 10-7ng/µL và 10-8ng/µL (tương ứng với ống 1, 2, 3); 2 mẫu bệnh 
dương tính (tương ứng với ống 4, 5); 2 mẫu âm tính (tương ứng với ống 6, 7). 
76 
Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại mỗi tháng 1 lần, 3 tháng một lần và sau 
12 tháng ở các điều kiện bảo quản 2-80C và - 200C ± 50C sau khi mở nắp bộ 
kit. 
Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ Kit sau 6 tháng bảo quản 
Nồng độ 
(ng/µL) 
Điều kiện bảo quản 2-80C sau mở nắp 
1/2019 2/2019 3/2019 4/2019 5/2019 6/2019 
10-6 (+) (+) (+) (+) (+) (+) 
10-7 (+) (+) (+) (+) (+) (+) 
10-8 (+) (+) (+) (+) (+) (+) 
Mẫu dương 1 
(5,1 x 10-6) 
(+) (+) (+) (+) (+) (+) 
Mẫu dương 2 
(4,2 x 10-7) 
(+) (+) (+) (+) (+) (+) 
Neg 1 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 
Neg 2 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 
Như vậy, bộ kit vẫn hoạt động ổn định sau 6 tháng mở nắp sử dụng. 
77 
Hình 3.17A. Kết quả khảo sát tính 
ổn định của bộ kit sau 1 tháng bảo 
quản quan sát dựa vào chỉ thị màu. 
Hình 3.17B. Kết quả khảo sát tính 
ổn định của bộ kit sau 6 tháng bảo 
quản quan sát dựa vào chỉ thị màu. 
Hình 3.18 Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP sau 1 tháng và 6 tháng bảo 
quản 
Làn 1-7: sản phẩm LAMP sau 1 tháng bảo quản. 
Làn 9-15: sản phẩm LAMP sau 6 tháng bảo quản. 
Hình ảnh của chất chỉ màu và điện di sản phẩm cũng cho thấy bộ kit vẫn hoạt 
động ổn định sau 6 tháng mở nắp sử dụng
78 
Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ ổn định sau 4 lần làm tan và đông đá. 
Nồng độ 
(ng/µL) 
Điều kiện bảo quản - 200C ± 50C sau 
khi mở nắp 
 2/2019 5/2019 8/2019 12/2019 
10-6 (+) (+) (+) (+) 
10-7 (+) (+) (+) (+) 
10-8 (+) (+) (+) (-) 
Mẫu dương 1 (+) (+) (+) (-) 
Mẫu dương 2 (+) (+) (+) (-) 
Neg 1 (-) (-) (-) (-) 
Neg 2 (-) (-) (-) (-) 
Bộ kit không còn ổn định khi tiến hành làm tan và đông đá trở lại ở lần 
thứ 4. 
79 
Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ Kit sau 12 tháng bảo quản. 
Nồng độ 
(ng/µL) 
Điều kiện bảo quản - 200C ± 50C 
Lần 1: tháng 1/