Luận án Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

h sạch DNA (QIAquick Gel Extraction Kit) và tách chiết plasmid 
(QIAprep Spin Miniprep Kit) (QIAGEN); Các loại enzyme cắt giới hạn và các hoá 
chất thông dụng khác (X-gal, agarose) của các hãng Merck, Sigma, Amersham 
Pharmacia Biotech; Taq polymerase, dNTPs, thang DNA 1 kb của hãng Fermentas 
(Mỹ). 
Các hóa chất yeast extract, bacto pepton, trypton, NaCl, agarose, sucrose, 
glycerol, DDT, L-Cystein, Na2S2O3, PPT; các chất điều hòa sinh trưởng BAP, IBA...; 
kháng sinh spectinomcine, rifamicine, cefotaxime... được cung cấp bởi các hãng: 
New England Biolabs (Anh), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals 
(Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Merck (Đức) và Wako (Nhật Bản). 
Quá trình tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương sử dụng các môi trường 
MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung B5 (Gamborg, 1968); GM, SIM, 
SEM, RM. Môi trường nuôi khuẩn và tạo huyền phù khuẩn: YEB, CCM. 
2.2.2. Thiết bị 
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật và chuyển gen gồm 
box cấy, bình tam giác, dàn nuôi cấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy 
đo OD 
Các thiết bị sử dụng trong sinh học phân tử gồm máy PCR system 9700 
(Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi 
DNA (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia 
Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Minishaker, IKA, Đức), máy hút chân không 
(Savant), máy li tâm (Eppendorf), máy ổn nhiệt, máy biến nạp bằng xung điện, máy 
voltex... và các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng 
thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học. 
` 
49 
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 
Thiết kế vector biểu hiện gen thực vật chứa cấu trúc mang gen codA và 
đánh giá hoạt động của vector mang gen chuyển codA trên cây mô hình 
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nhằm thăm dò 
hiệu quả chuyển gen codA ở cây đậu tương 
Biến nạp cấu trúc mang gen codA vào giống đậu tương 
ĐT22 và tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn 
Phân tích cây đậu tương chuyển gen codA ở thế hệ T
0
, T
1
Đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng đậu 
tương chuyển gen codA dưới điều kiện hạn nhân tạo 
Sàng lọc cây chuyển gen 
bằng chấy diệt cỏ và PCR 
Kiểm tra sự hợp nhất và sự biểu 
hiện của gen chuyển codA trong 
cây đậu tương chuyển gen 
Đánh giá sức nảy 
mầm của hạt dưới 
điều kiện hạn nhân 
tạo 
Đánh giá khả năng 
sinh trưởng và chịu 
hạn của cây đậu tương 
chuyển gen dưới điều 
kiện hạn nhân tạo 
Đánh giá các chỉ số 
hoá sinh của cây đậu 
tương chuyển gen 
dưới điều kiện hạn 
nhân tạo 
Chọn dòng đậu tương chuyển gen có khả năng chịu hạn cao 
` 
50 
2.3.1. Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen codA và chuyển gen ở 
thuốc lá 
2.3.1.1. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen codA 
Phương pháp tạo cấu trúc mang gen chuyển codA 
Thực hiện các phản ứng cắt enzyme giới hạn, lai tạo vector tái tổ hợp. 
Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn theo phương pháp xung điện 
của Cohen và cs (1972) [40]. DNA tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp 
PCR với mồi codA-F/R. Cắt đồng thời plasmid vector pIBTII và pCAMBIA-HSP-
codA, pCAMBIA-35S-codA, pCAMBIA-rd29A-codA bằng cặp enzyme giới hạn 
HindIII và EcoRI để tạo các đầu dính tương ứng. 
Plasmid pIBTII và pCAMBIA-HSP-codA, pCAMBIA-35S-codA, pCAMBIA-
rd29A-codA sau khi tinh sạch được cắt với HindIII và EcoRI. Sản phẩm cắt được 
điện di trên gel agarose 0,8%. Các phân đoạn 8,8 Kb của pIBTII được tinh sạch và 
2,4 kb, 2,7 kb và 2,6 kb của pCAMBIA-HSP-codA, pCAMBIA-35S-codA, 
pCAMBIA-rd29A-codA được thu hồi bằng phương pháp thôi gel. 
Sản phẩm cắt được tinh sạch bằng GeneJET PCR Purification Kit của hãng 
Thermo Scientific như sau: Thêm vào 25 µl binding buffer, trộn đều. Cho toàn bộ 
dịch lên cột ly tâm. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch qua cột. Thêm 
vào cột 500 Wash buffer. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch qua cột. 
Ly tâm tiếp 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột ly tâm sang ống 1,5 ml. 
Thêm vào cột ly tâm 30 µl nước khử ion vô trùng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. 
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu lấy dịch. 
DNA trên gel agarose được thu hồi bằng cách ủ phân đoạn gel với binding 
buffer tỉ lệ 1:1 để hòa tan gel. Sau đó thực hiện tương tự các bước như bên trên. 
Phương pháp gắn cấu trúc mang gen chuyển codA vào vector chuyển gen pIBTII
51 
Hình 2.3. Sơ đồ các vector pIBTII-rd29A-codA, pIBTII-HSP-codA, pIBTII-35S-codA 
Tvsp: Terminator from soybean vegetative storage protein gene, Tnos: NOS terminator 
Bar: gen kháng phosphinothricin, Rd29A: promoter cảm ứng stress hạn, HSP: Heat shock 
promoter, 35S: promoter CaMV35S, codA: gen mã hóa cho choline oxidase; HindIII, 
XbaI, SacI, EcoRI...: vị trí các điểm cắt của enzyme giới hạn 
Phân đoạn của pIBTII và phân đoạn của 35S-codA-Nos, rd29A-codA-Nos, 
HSP-codA-Nos sau khi được tinh sạch được ghép nối với nhau bằng phản ứng 
ligase và được biến nạp vào E. coli để kiểm tra vector tái tổ hợp. Thành phần phản 
ứng nối với T4 ligase được trình bày trong bảng 2.2. Sơ đồ cấu trúc của các vector 
pIBTII-rd29A-codA, pIBTII-HSP-codA, pIBTII-35S-codA được mô tả trong hình 2.2. 
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 30 phút. Sau đó đặt hỗn hợp phản ứng 
lên đá lạnh và tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Dịch 
khuẩn sau biến nạp được trải trên đĩa thạch LB chứa spectinomycine 50 mg/l. 
Khuẩn lạc được kiểm tra bằng phương pháp clony-PCR với mồi codA-F/R. 
Các khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR được nuôi lỏng và tách plasmid. 
Kiểm tra plasmid bằng phản ứng cắt với HindIII và EcoRI. 
52 
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng nối với T4 ligase 
STT Thành phần phản ứng Thể tích(µl) 
1 Phân đoạn của plasmid pIBTII 25 ng/µl 2 
2 Đoạn mang gen chuyển codA 10 ng/µl 2 
3 T4 DNA ligase Buffer 10X 2 
4 T4 DNA ligase (10U/µl) 1 
5 H2O deion 13 
Tổng 20 
Phương pháp tạo chủng A. tumefaciens C58 chứa vector chuyển gen codA 
Tế bào khả biến đặt trong đá 10 -15 phút. Bổ sung 1 µl vector chuyển gen vào 
ống tế bào khả biến và trộn nhẹ. Rửa cuvette bằng cồn 100o, rửa lại bằng nước khử 
ion, khử trùng rồi thấm khô. Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens C58 + 
vector chuyển gen vào cuvette. Xung điện: 2,5 kv, 25µF và điện trở 400. Đặt 
ngay vào đá. Sau 5- 10 phút bổ sung 300 µl LB và trộn nhẹ. Chuyển sang ống 
Eppendorf 2 ml. Ủ ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Cấy trải dịch 
vào đĩa chọn lọc chứa kháng sinh spectinomycine 50 mg/l và rifamicine 50 mg/l. Ủ 
ở 28oC trong 48 giờ. 
Khuẩn lạc được sàng lọc bằng phương pháp clony-PCR. Dòng khuẩn lạc 
dương tính sẽ được giữ lại nuôi trong môi trường LB lỏng để sử dụng trong các thí 
nghiệm chuyển gen. 
2.3.1.2. Chuyển các cấu trúc vector sau thiết kế vào cây thuốc là và kiểm tra sự 
có mặt của gen chuyển 
Vector tái tổ hợp được chuyển vào thuốc lá giống K326 theo phương pháp 
của Topping (1998) [154]. Các dòng thuốc lá chuyển gen được phân tích PCR với 2 
cặp mồi codA F/R, bar F/R và được đánh giá khả năng tạo chồi và tạo rễ trong điều 
kiện hạn sinh lý bằng polyethylene glycol (PEG) 8000 2,5%. 
53 
2.3.1.3. Phân tích hàm lượng glycine betaine trong cây thuốc lá chuyển gen 
Lá của các cây thuốc lá chuyển gen sau khi gây hạn nhân tạo được thu thập 
và đánh giá hàm lượng GB tích lũy theo phương pháp của Grieve và Grattan (1983) 
[66]. Lấy 0,5 g mẫu lá thuốc lá đã sấy khô nghiền mịn, bổ sung 20 ml nước deion, 
lắc 200 vòng/phút ở 25 oC trong 24 giờ. Dịch chiết được loại bỏ cặn và pha loãng 
với H2SO4 2N theo tỷ lệ 1:1, đặt trên đá trong 1 giờ. 0,50 ml hỗn hợp được đưa vào 
ống chứa sẵn 0,20 ml thuốc thử KI-I2 lạnh sau đó lắc đều. Hỗn hợp phản ứng giữ ở 
4oC trong 16 giờ, sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút ở 0oC trong 10 phút. 
Loại bỏ dung dịch, cặn thu được được cho phản ứng với 9,0 ml thuốc thử 1,2-
dichloroethane. Sau 2- 2,5 giờ, tiến hành đo độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở 
bước sóng 365 nm bằng máy đo quang phổ. Nồng độ GB trong các mẫu thí nghiệm 
được xác định dựa trên đường chuẩn của dung dịch GB chuẩn. Các số liệu thu được 
trong nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm GraphPad Prism (V7.04 của GraphPad 
software Inc, Mỹ). 
2.3.2. Nhóm phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp cho chuyển gen ở 
giống đậu tương ĐT22 
2.3.2.1. Khử trùng hạt 
Hạt đậu tương ĐT22 to tròn đều, màu vàng sáng, vỏ hạt không bị nứt được 
chọn làm vật liệu chuyển gen. Hạt chín được khử trùng bằng khí Chlor (Cl2). Khí 
chlore được tạo ra bằng cách bổ sung 3 ml HCl đậm đặc vào 100 ml javen thương 
phẩm. Việc khử trùng được thực hiện trong một bình kín và đặt trong tủ hút 14- 16 
giờ. Sau khi khử trùng, hạt được gieo trên môi trường GM trong thời gian 5-7 ngày. 
2.3.2.2. Chuẩn bị khuẩn 
Các loại môi trường sử dụng trong quá trình nuôi cấy tạo dịch huyền phù vi 
khuẩn gồm: môi trường nuôi khuẩn đặc, môi trường nuôi khuẩn lỏng và môi trường 
tạo dịch huyền phù vi khuẩn (bảng 2.3). 
54 
Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: cấy trải A. tumefaciens mang gen codA từ ống giữ 
chủng lên môi trường YEP đặc có bổ sung kháng sinh phù hợp, nuôi trong tủ ổn 
nhiệt 28oC trong thời gian 48 giờ. 
Nuôi lỏng khuẩn: dùng que cấy chọn một khuẩn lạc riêng biệt trên đĩa khuẩn 
cấy vào môi trường YEP lỏng bổ sung các loại kháng sinh như nuôi đặc. Bình nuôi 
lỏng được lắc 200 v/p ở 28oC trong 16 giờ trong điều kiện tối hoàn toàn. 
Bảng 2.3. Môi trường nuôi khuẩn 
Yeast extract peptone (YEB) đặc 
yeast extract (10 g/l) + NaCl (5 g/l) + 
tryptone (10 g/l) + 15g/l Bacto agar, pH = 7 
Yeast extract peptone (YEP) lỏng 
yeast extract (10 g/l) + NaCl (5 g/l) + 
tryptone (10 g/l), pH = 7 
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: Lấy 5ml dịch khuẩn thu từ quá trình nuôi lỏng 
bổ sung thêm vừa đủ 50ml và tiếp tục nuôi phục hồi 4- 6 giờ. Sau đó dịch khuẩn 
được ly tâm ở 5000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Loại bỏ phần dịch nổi và hòa tan cặn 
khuẩn trong môi trường CCM lỏng có bổ sung acetosyrigone (AS) để đạt mật độ 
huyền phù vi khuẩn OD650 0,4– 1,0. 
2.3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả chuyển gen codA 
Vector tái tổ hợp pIBTII/rd29A-codA được biến nạp vào chủng khuẩn A. 
tumefaciens C58/pGV2206 tạo A. tumefaciens tái tổ hợp. Chủng A. tumefaciens 
mang vector pIBTII/rd29A-codA được lây nhiễm vào giống đậu tương ĐT22 qua 
nách lá mầm theo phương pháp của Olhoft và cs [115]. Xác định hàm lượng PPT 
sử dụng chọn lọc các chồi chuyển gen thí nghiệm từ môi trường SIM2 có bổ sung 
PPT với 5 mức nồng độ (0; 1; 3; 5; 7) mg/l. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khuẩn 
Agrobacterium ở OD650 sử dụng cho chuyển gen vào đậu tương với dịch khuẩn có 
giá trị OD650 lần lượt là 0,4; 0,6; 0,8 và 1,0 với thời gian lây nhiễm 30 phút. Nghiên 
55 
cứu ảnh hưởng của thời gian ủ khuẩn Agrobacterium và đồng nuôi cấy đến hiệu 
quả chuyển gen ở giống đậu tương ĐT22 được thực hiện với các khoảng thời gian ủ 
lần lượt là: 15 phút; 30 phút; 45 phút; thời gian đồng nuôi cấy 2 ngày, 5 ngày và 8 
ngày. Xác định nồng độ kháng sinh cefotaxime bổ sung vào môi trường rửa khuẩn 
(SIM lỏng) và thời gian rửa khuẩn sau 5 ngày đồng nuôi cấy ở các ngưỡng nồng độ là: 
200 mg/l, 500 mg/l và 1000 mg/l với thời gian rửa khuẩn nghiên cứu là 5 phút, 10 
phút, và 15 phút. 
2.3.3. Nhóm phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen codA 
2.3.3.1. Biến nạp di truyền và tạo cây đậu tương chuyển gen 
Ba vector tái tổ hợp pIBTII-rd29A-codA, pIBTII-HSP-codA, pIBTII-35S-
codA được biến nạp vào giống đậu tương ĐT22 bằng phương pháp biến nạp thông 
qua nách lá mầm theo phương pháp của Olhoft và cs (2001), có cải tiến [115]. 
Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen codA ở đậu tương được trình bày 
trong bảng 2.4. 
Các cụm đa chồi sau 2 tuần phát triển trên môi trường cảm ứng tạo chồi 
SIM1 (không chứa PPT) tiếp tục được chọn lọc lần lượt trên môi trường cảm ứng 
tạo chồi SIM2 (có bổ sung PPT 3 mg/l) và các môi trường kéo dài chồi SEM1, 
SEM2 (có bổ sung PPT 1,5 mg/l)... tương ứng với số lần cấy chuyển. Các chồi 
sống sót sau các lần chọn lọc được cắt tạo rễ trên môi trường RM có bổ sung IBA. 
Sau 7- 12 ngày, các chồi có bộ rễ hoàn chỉnh được trồng ra đất trong phòng thích 
nghi sinh trưởng và được kiểm tra sự có mặt của gen chọn lọc và gen đích bằng 
phương pháp phết chất diệt cỏ và kỹ thuật PCR. 
 Sàng lọc cây chuyển gen bằng chất diệt cỏ 
Các dòng đậu tương chuyển gen được sàng lọc và xác định bằng thử tính 
kháng chất diệt cỏ theo phương pháp của Brettschneider và cs (1997) [29]. Dung 
dịch thuốc diệt cỏ PPT 250mg/l bổ sung 0,1 % Tween 20 được thấm trên tăm bông, 
phết trực tiếp lên bề mặt trên của lá của cây đậu tương cách phần ngọn lá khoảng 
1,5 cm. Kết quả được ghi nhận sau 3-5 ngày tiến hành. 
56 
Bảng 2.4. Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen codA ở đậu tương 
Môi trường Thành phần 
Hạt nảy mầm 
(germination 
medium – GM) 
Muối B5 3,052 g/l + sucrose 20 g/l + gellan 2,5 g/l, pH = 5,8 
có bổ sung vitamin B5 1000X 1 ml/l. 
Dịch huyền phù 
(co-cultivation 
medium - CCM 
lỏng) 
Muối B5 0,316g/l + MES 3,9g/l + sucrose 30 g/l pH = 5,4 có 
bổ sung acetosyringone 40 mg/l + dithiothreitol 154 mg/l + L-
cysteine 400 mg/l + sodium thiosulfate 158 mg/l + vitamin 
B5 1000X 1 ml/l + BAP 1,67 mg/l + GA3 0,25 mg/l. 
Đồng nuôi cấy 
(CCM đặc) 
Muối B5 0,316 g/l + MES 3,9 g/l + Sucrose 30 g/l + 6 agar g/l, 
pH = 5,4 có bổ sung acetosyringone 0,04 g/l + vitamin B5 
1000X 1 ml/l + BAP 1,67 mg/l + GA3 0,25 mg/l. 
Diệt khuẩn và 
tạo đa chồi (shoot 
induction 
medium- SIM) 
Muối B5 3,052 g/l + MES 0,59 g/l + sucrose 30 g/l + agar 8 
g/l, pH = 5,8, bổ sung BAP 1,67 mg/l + cefotaxime 500 mg/l 
+ vitamin B5 1000X 1 ml/l. 
Kéo dài chồi 
(shoot elongation 
medium- SEM) 
MS 4,3 g/l + MES 0,59 g/l + sucrose 30 g/l + nước dừa 200 
ml/l + gellan 2,5 g/l, pH = 5,8 có bổ sung cefotaxime 500 
mg/l + vitamin B5 1000X 1 ml/l + GA3 0,5 mg/l + IAA 100 
mg/l + L-asparagine monohydrate 50 mg/l. 
Ra rễ (rooting 
medium- RM) 
MS 4,3 g/l + sucrose 20 g/l + MES 0,59 g/l + gellan 2,5 g/l, 
pH = 5,8 có bổ sung cefotaxime 250 mg/l + IBA 0,1 mg/l + 
vitamin B5 1000X 1 ml/l + L-asparagine monohydrate 50 
mg/l. 
57 
2.3.3.2. Phân tích cây đậu tương chuyển gen 
Kỹ thuật PCR 
DNA tổng số của các dòng đậu tương chuyển gen được tách chiết từ lá bằng 
phương pháp sử dụng CTAB của Delllaporta và cs (1983) [46]. Sau đó, xác định sự 
có mặt của gen codA và gen bar bằng PCR thông qua cặp mồi đặc hiệu codA-F/R 
và gen bar-F/R (bảng 2.1). Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện 
di gel agarose 0,8%. 
Kỹ thuật Southern blot 
Các dòng đậu tương chuyển gen codA lựa chọn từ các dòng chuyển gen đã 
sàng lọc bằng chất diệt cỏ và kỹ thuật PCR được sử dụng để đánh giá sự có mặt và 
số bản copy trong hệ gen đậu tương thông qua phương pháp lai southern blot. DNA 
tinh sạch từ mẫu lá được cắt bằng EcoRI. Sản phẩm cắt được điện di trên gel 
agarose 1%, sau đó được chuyển lên và cố định trên màng Zeta-Probe® GT (Bio-
Rad, Hercules, CA, Mỹ). DNA được cố định trên màng nylon bằng tia UV. Đoạn 
sản phẩm PCR kích thước 500 bp được nhân bằng cặp mồi của gen codA, được sử 
dụng làm mẫu dò cho phản ứng lai Southern. Bộ kit Prime-It® RmT Random Primer 
Labelling Kit (Stratagene, La Jolla, CA, Mỹ) được sử dụng để tạo mẫu dò bằng đồng 
vị 32P theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bước lai và rửa màng được thực hiện ở 65°C 
theo hướng dẫn của nhà sản xuất Bio-Rad, Hercules, CA, Mỹ. Các công đoạn trong 
phân tích Southern Blot được thực hiện tại Trung tâm chuyển gen thực vật thuộc Đại 
học Missouri, Hoa Kỳ. 
Kỹ thuật Western blot 
Các dòng đậu tương chuyển gen codA được kiểm tra với thuốc diệt cỏ để chọn 
các cây không mẫn cảm. Các cây này tiếp tục được xử lý hạn đối với cấu trúc 
rd29A-codA. Sau đó lá của các cây này được thu để tách và tiến hành kiểm tra biểu 
hiện protein bằng kỹ thuật Western blot với các bước cơ bản sau: (i) Protein tổng số 
từ mẫu lá được tách bằng dịch chiết PBS (phosphate-buffered saline) 0,05% Tween 
58 
20 theo tỉ lệ 1: 2 (gam mẫu: ml dịch chiết), ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút; 
(ii) Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide- SDS 10%; (iii) Chuyển 
protein trên gel điện di lên màng lai nitrocellulose bằng máy Pierce G2 Fast Blotter 
(25V, 1,3 mA trong 20 phút); (iv) Màng chứa kháng nguyên c-myc được phủ bằng 
5% sữa tách béo pha trong dung dịch PBS + Tween 0,05% trong 16 giờ; (v) Lai 
kháng thể 1 (ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS 5% sữa tách béo có chứa 
kháng thể c-myc với độ pha loãng 700 lần, lắc ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ); (vi) 
Lai kháng thể 2 (ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS + 5% sữa tách béo có 
chứa kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horse Radish Peroxidase) trong 2 
giờ); (vii) Hiện màu trong dung dịch có chứa cơ chất TMB (3,3',5,5'- tetramethyl 
benzidine) hoặc DAB (3,3'- diaminobenzidine tetrahydrochloride), hiển thị kết quả 
dưới ánh sáng thường. 
2.3.3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng cây chuyển gen trong điều 
kiện hạn nhân tạo 
Đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng cây chuyển gen 
Các hạt đậu tương chuyển gen được khử trùng bề mặt bằng khí Cl2 và được 
gieo trên môi trường MS có bổ sung vitamin, 2,5 g/l phytagel và các nồng độ 
PEG8000 khác nhau để đánh giá khả năng nảy mầm. Các đĩa hạt được đặt trong 
phòng nuôi có nhiệt độ 28°C và chu kỳ sáng/tối 16/8. Chiều dài rễ được ghi lại sau 
12 ngày gieo trên môi trường xử lý. 
Hạt của các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1 và giống ĐT22 được trồng 
riêng biệt trong các chậu đất (115 x 85 x 105 cm). Tiến hành phết PPT để sàng lọc 
được các cây chuyển gen kháng chất diệt cỏ. Các cây chuyển gen kháng chất diệt 
cỏ của các dòng chuyển gen được chăm sóc đạt đến giai đoạn sinh trưởng V3 để 
đưa vào thí nghiệm chịu hạn nhân tạo. Điều kiện hạn nhân tạo được thiết đặt trong 
buồng sinh trưởng với nhiệt độ 30-33°C và độ ẩm tương đối đạt 60%. Điều kiện 
sinh trưởng đối chứng được thiết đặt song song trong buồng sinh trưởng độc lập 
khác ở nhiệt độ 28°C và độ ẩm tương đối đạt 80%; các cây trong điều kiện đối 
59 
chứng được chăm sóc bình thường trong suốt quá trình thí nghiệm. Các cây thí 
nghiệm được tưới đầy đủ một lần trước được đưa vào các điều kiện thí nghiệm. 
Phân tích các chỉ số hóa sinh ở cây đậu tương chuyển gen trong các thí nghiệm 
chịu hạn 
Hàm lượng GB tích lũy trong lá của các dòng đậu tương chuyển gen chịu hạn 
và không chịu hạn được xác định theo phương pháp của Grieve và Grattan (1983) 
[66]. Cụ thể: Nghiền mịn 0,5 g mẫu lá đã sấy khô, sau đó bổ sung 20 ml nước deion 
và lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ ở 25 oC. Dịch chiết được loại bỏ cặn và pha 
loãng với H2SO4 2N theo tỷ lệ 1:1 và đặt trên đá trong 1 giờ. 0,50 ml hỗn hợp được 
đưa vào ống chứa sẵn 0,20 ml thuốc thử KI-I2 lạnh (bao gồm 15,7g I2 và 20,0 g KI 
hòa tan trong 100 ml nước deion) sau đó lắc đều. Hỗn hợp phản ứng được giữ ở 
4oC trong 16 giờ và sau đó được ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút 
ở 0oC. Loại bỏ cẩn thận dung dịch bằng micropipet. Cặn thu được được cho phản 
ứng với 9,0 ml thuốc thử 1,2-dichloroethane. Sau 2- 2,5 giờ, tiến hành đo độ hấp 
thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 365 nm bằng máy đo quang phổ. Nồng độ 
GB trong các mẫu thí nghiệm được xác định dựa trên đường chuẩn của dung dịch 
GB chuẩn. 
Chỉ số MDA, proline và hoạt độ POD theo phương pháp của Chen và Zhang 
(2016) [35]. Cụ thể: 
Tách chiết dịch protein/enzyme tổng số: 0,2 g lá tươi được nghiền bằng nitơ 
lỏng và chiết bằng 3 ml đệm chiết PBS pH7,8 lạnh trong 3-5 phút. Tiếp đó, ly tâm 
hỗn dịch ở 10000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4°C. Dịch chiết được xác định nồng 
độ theo phương pháp Bradford và chia thành các phần nhỏ, bảo quản ở -80°C để sử 
dụng cho các phản ứng định lượng tiếp sau. 
Xác định hàm lượng proline: Hàm lượng proline trong các mẫu thí nghiệm 
được xác định bằng dung dịch phản ứng có chứa 2,5% ninhydrin acid, 3% 
sulphosalicylic acid. Cụ thể