Luận án Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps Sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính Sinh học

hối 
NT. KT. Sac. Pep. NM. KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 TN. MH. 
1 150 60 15 15 0,5 0,5 0,1 25,4 24,3 
2 250 60 5 15 1,5 1,5 0,1 27,3 26,8 
3 250 60 5 5 0,5 1,5 0,1 24,2 24,7 
4 150 40 15 5 1,5 1,5 0,1 22,1 21,6 
5 150 60 15 5 1,5 1,5 1 28,3 28,8 
6 150 60 5 15 1,5 0,5 1 23,6 24,3 
7 250 40 15 15 0,5 1,5 1 22,1 22,6 
8 150 40 5 5 0,5 0,5 0,1 14,3 15,0 
9 250 40 5 1 1,5 0,5 1 21,1 20,1 
10 150 40 5 15 0,5 1,5 1 17,4 16,9 
11 250 60 15 5 0,5 0,5 1 28,2 27,8 
12 250 40 15 15 1,5 0,5 0,1 22,1 22,8 
NT. Nghiệm thức; KT. Khoai tây; Sac. Saccharose; Pep. Peptone; NM. Cao nấm 
men; TN. Thực nghiệm; MH. Mô hình 
45 
Bảng 3.2. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình 
Tên yếu tố 
Kí 
hiệu 
Mức Mức độ ảnh hưởng 
Thấp (-1) Cao (+1) 
Ảnh 
hưởng 
Prob > F 
Mô hình 0,0019 
Khoai tây (g/L) X1 150 250 1,03a 0,0172 
Saccharose (g/L) X2 40 60 3,28a 0,0002 
Peptone (g/L) X3 5 15 1,82a 0,0023 
Cao nấm men (g/L) X4 5 15 -0,13b 0,6518 
KH2PO4 (g/L) X5 0,5 1,5 1,19a 0,0105 
K2HPO4 (g/L) X6 0,5 1,5 0,67b 0,0625 
MgCl2 (g/L) X7 0,1 1 0,56b 0,1006 
R2 = 0,9844; CV = 3,93%; R2-điều chỉnh = 0,9571; R2-dự đoán = 0,8595, 
Adeq Precision = 20,286; aCó ý nghĩa ở độ tin cậy α = 0,05; bKhông có ý nghĩa ở 
độ tin cậy α = 0,05. 
Trong khoai tây chứa nhiều dinh dưỡng như nguồn carbon, nitơ, khoáng và 
vitamin nên nó thường được sử dụng làm môi trường nền trong nuôi cấy vi sinh vật. 
Đối với saccharose, đây là disaccharide khi thủy phân sẽ tạo ra glucose và fructose 
tốt cho sự phát triển của nấm và có giá thành thấp. Nhiều nghiên cứu về Cordyceps 
cũng cho thấy khi sử dụng saccharose thì khối lượng sinh khối đạt cao nhất. Ngoài 
ra, kết quả cho thấy peptone có ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối của nấm C. sinensis, 
tuy nhiên một số nghiên cứu cho rằng cao nấm men hoặc cao thịt bò là nguồn nitơ 
phù hợp. Sự khác biệt này có thể do chủng giống cũng như điều kiện nuôi cấy khác 
nhau. Bên cạnh đó, sự sinh trưởng của nấm C. sinensis còn chịu ảnh hưởng bởi pH, 
trong đó pH phù hợp khoảng 5,5 - 6,5. Do đó, khi bổ sung KH2PO4 ngoài việc cung 
cấp nguồn K, P còn tạo ra hệ đệm cần thiết cho nấm sinh trưởng và phát triển. Từ kết 
quả sàng lọc bằng Plackett – Burman, có thể thấy saccharose, peptone, khoai tây và 
KH2PO4 là những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến khả năng sản xuất sinh khối. Kết quả 
46 
này tạo tiền đề tối ưu môi trường nuôi cấy theo phương pháp đáp ứng bề mặt Box - 
Behnken. Sau khi tiến hành đánh giá sự ảnh hưởng của môi trường đến lượng sinh 
khối, tiếp tục đánh giá tác động của những yếu tố này đến khả năng tích lũy Se. Kết 
quả được trình bày trong bảng 3.3. Lượng Se tổng tích lũy trong sinh khối nấm đều 
cao vượt trội so với đối chứng (14,0µg) dao động từ 14145,0µg đến 23334,5µg (bảng 
3.3), điều này chứng tỏ C. sinensis có khả năng tích lũy Se cao trong môi trường thực 
nghiệm. Khi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng 
tích lũy Se bằng mô hình Plackett - Burman cho thấy mô hình không có ý nghĩa thống 
kê (p > 0,05) (bảng 3.4). Như vậy, những thành phần môi trường trong nuôi cấy gồm 
khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 không ảnh 
hưởng nhiều đến sự tích lũy Se trong sinh khối hệ sợi nấm C. sinensis. 
47 
Bảng 3.3. Lượng Se tổng (µg) trong sinh khối của các nghiệm thức theo Plackett 
- Burman 
(*) Lượng Se tổng của sinh khối từ 1L môi trường nuôi cấy = hàm lượng Se (µg/g) * 
trọng lượng sinh khối (g/L). NT. Nghiệm thức; KT. Khoai tây; Sac. Saccharose; Pep. 
Peptone; NM. Cao nấm men; TN. Thực nghiệm; MH. Mô hình 
 Thành phần môi trường (g/L) Selen* 
NT. KT. Sac. Pep. NM. KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 TN. MH. 
1 150 60 15 15 0,5 0,5 0,1 19837,4 17791,4 
2 250 60 5 15 1,5 1,5 0,1 22159,5 19284,2 
3 250 60 5 5 0,5 1,5 0,1 18571,4 21446,7 
4 150 40 15 5 1,5 1,5 0,1 19333,3 20141,9 
5 150 60 15 5 1,5 1,5 1 23334,5 22525,9 
6 150 60 5 15 1,5 0,5 1 16857,5 19189,0 
7 250 40 15 15 0,5 1,5 1 17023,6 15956,7 
8 150 40 5 5 0,5 0,5 0,1 20320,1 18967,6 
9 250 40 5 1 1,5 0,5 1 23155,9 21109,9 
10 150 40 5 15 0,5 1,5 1 14145,0 15212,0 
11 250 60 15 5 0,5 0,5 1 21573,0 22096,2 
12 250 40 15 15 1,5 0,5 0,1 14959,9 17549,7 
48 
Bảng 3.4. Phân tích ANOVA về mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến 
lượng Se tổng trong sinh khối nấm 
Tên yếu tố Kí hiệu 
Mức độ ảnh hưởng 
Ảnh hưởng Prob > F 
Mô hình 0,6250 
Khoai tây (g/L) X1 301,29 0,7655 
Saccharose (g/L) X2 1116,28 0,3023 
Peptone (g/L) X3 71,03 0,9436 
Cao nấm men (g/L) X4 -1775,43 0,1330 
KH2PO4 (g/L) X5 694,17 0,5027 
K2HPO4 (g/L) X6 -178,04 0,8595 
MgCl2 (g/L) X7 75,68 0,9399 
3.2.2 Tối ưu hóa thành phần môi trường 
Việc tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng giúp chúng ta có thể đánh 
giá được sự tương tác giữa các yếu tố và giảm đáng kể được số lượng thí nghiệm cần 
thực hiện. Dựa vào thí nghiệm sàng lọc bằng Plackett - Burman, chọn được 3 yếu tố 
là saccharose, peptone, KH2PO4 là 3 yếu tố có tác động mạnh nhất đến sinh khối nấm, 
để tiến hành tối ưu hóa theo mô hình Box - Behnken gồm 17 nghiệm thức ở ba mức 
-1, 0, +1 với môi trường nền gồm khoai tây (200g/L), cao nấm men (4g/L), K2HPO4 
(0,5g/L), MgCl2 (0,1g/L). Sự sinh trưởng của nấm được quan sát và đánh giá theo 
từng giai đoạn 10, 20, 30, 40 ngày. Nhìn chung, nấm đều có sự tăng trưởng tốt và 
đồng đều giữa các nghiệm thức. Sau thời gian nuôi cấy lỏng tĩnh 10 ngày, các nghiệm 
thức 1, 9, 13, 17 hệ sợi lan chậm, yếu và sinh khối mỏng, phân thành từng mảng, màu 
môi trường vàng nhạt. Những nghiệm thức 3, 6, 7, 8, 14, 15, 16 có sự phát triển mạnh 
hơn, sinh khối đã lan đầy bề mặt môi trường, hệ sợi tương đối dày tùy theo từng 
nghiệm thức. Kết quả được tóm tắt trong phụ lục 9. Sau thời gian 20, 30 ngày nấm 
tiếp tục tăng trưởng và hệ sợi phủ đầy bề mặt hộp và chủ yếu nấm tăng bề dày của 
sinh khối và màu môi trường có sự thay đổi sang vàng đậm đến đỏ nâu. Đến thời 
điểm 40 ngày, tiến hành thu sinh khối, đa số các nghiệm thức đều tăng trưởng tương 
đối đồng đều, hệ sợi mọc dày, mạnh (phụ lục 10). Một số nghiệm thức 2, 3, 6, 7, 11, 
14, 15, 17 sinh trưởng tốt hơn những nghiệm thức còn lại. Sau thời gian 40 ngày, tiến 
49 
hành thu sinh khối và sấy ở 60°C đến khi khối lượng không đổi, kết quả trình bày 
như bảng 3.5. Trọng lượng sinh khối thực nghiệm không có sự chênh lệch đáng kể so 
với kết quả dự đoán bằng phần mềm DE. 
Bảng 3.5. Sản lượng sinh khối nấm Cordyceps sinensis (g/L) của các nghiệm thức 
theo Box – Behnken và hàm lượng Se tổng (µg) trong sinh khối. 
 Thành phần môi trường (g/L) Sinh khối Se* 
NT. Sacc. Pep. KH2PO4 TN. MH. TN. 
1 40 10 1,5 19,0 18,9 10627 
2 50 10 1 25,3 26,2 21289 
3 50 10 1 26,1 26,2 18286 
4 50 15 0,5 22,5 22,5 24805 
5 60 10 0,5 22,1 22,2 12115 
6 50 10 1 26,8 26,2 20654 
7 50 10 1 26,6 26,2 22916 
8 40 15 1 22,1 22,0 16800 
9 40 10 0,5 17,6 17,8 20626 
10 60 10 1,5 23,3 23,2 19467 
11 50 10 1 26,2 26,2 22721 
12 50 5 1,5 22,6 22,6 21466 
13 50 5 0,5 22,5 22,3 18000 
14 50 15 1,5 24,0 24,2 17196 
15 60 15 1 24,8 24,7 24101 
16 40 5 1 19,3 19,4 14311 
17 60 5 1 25,3 25,4 13622 
Lượng selen tổng của sinh khối từ 1L môi trường nuôi cấy = hàm lượng Se 
(µg/g) * trọng lượng sinh khối (g/L). NT. Nghiệm thức; Sac. Saccharose; Pep. 
Peptone; TN. Thực nghiệm; MH. Mô hình 
Kết quả tiếp tục được phân tích bằng ANOVA một chiều. Bảng 3.6 cho thấy 
mô hình có ý nghĩa thống kê với p 0,75 chứng 
tỏ mô hình tương thích với thực nghiệm. Hơn nữa, R2 dự đoán (0,9556) tương thích 
50 
với R2 hiệu chỉnh (0,9722) và Adeq Precision = 23,965 > 4 chứng tỏ mô hình đủ độ 
chính xác cho thí nghiệm tối ưu hóa môi trường. 
Bảng 3.6. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình Box – Behnken 
Biến 
độc lập 
Tổng bình 
phương 
Bậc 
tự do 
Bình phương 
trung bình 
Sai số 
chuẩn 
F-
value 
p-value 
Mô hình 119,22 9 13,25 63,26 < 0,0001 
Y1 38,00 1 38,00 0,16 181,46 < 0,0001 
Y2 1,74 1 1,74 0,16 8,31 0,0235 
Y3 2,11 1 2,11 0,16 10,05 0,0157 
Y1Y2 2,74 1 2,74 0,23 13,08 0,0085 
Y1Y3 0,01 1 0,01 0,23 0,03 0,8616 
Y2Y3 0,48 1 0,48 0,23 2.31 0,1722 
Y12 34,16 1 34,16 0,22 163,14 < 0,0001 
Y22 0,87 1 0,87 0,22 4,16 0,0807 
Y32 33,70 1 33,70 0,22 160,90 < 0,0001 
R2 = 0,9879; CV = 1,96%; R2-điều chỉnh = 0,9722; R2-dự đoán = 0,9556; 
C.V% = 1,96; Adeq Precision = 23,965 
Phương trình hồi quy theo sinh khối như sau: 
Sinh khối (g/L) = -80,854 + 3,342Y1 + 1,166Y2 + 22,476Y3 – 0,0166Y1Y2 – 
0,008Y1Y3 + 0,058Y2Y3 – 0,029Y12 – 0,014Y22 – 10,909Y32 
Trong đó: Y1: saccharose (g/L), Y2: peptone (g/L), Y3: KH2PO4 (g/L). 
51 
Bên cạnh đó, để xác định sự tương tác của mỗi biến cho trọng lượng sinh khối 
nấm C. sinensis tối ưu, đồ thị tương tác bề mặt ba chiều được xây dựng với trục z thể 
hiện trọng lượng sinh khối và hai biến độc lập bất kỳ trục x, y và biến còn lại duy trì 
ở mức tối ưu. Quy luật của sự tương tác giữa các yếu tố được thể hiện qua hình 3.5. 
 Bề mặt đáp ứng của sinh khối nấm Cordyceps sinensis theo hai yếu tố. 
(A) tương tác của peptone và saccharose với KH2PO4 cố định (1,05g/L); (B) tương 
tác của KH2PO4 và peptone với saccharose cố định (53,48g/L); (C) KH2PO4 và 
saccharose với peptone cố định (11,17g/L). 
Chúng tôi tiếp tục đánh giá sự tích lũy Se của nấm C. sinensis trong các nghiệm 
thức của mô hình tối ưu. Kết quả cho thấy lượng Se tổng trong sinh khối dao động từ 
10627µg đến 24805µg (bảng 3.5). Sau khi phân tích các số liệu của mô hình Box – 
Behnken, sử dụng phần mềm DE để dự đoán thành phần môi trường tối ưu cho sự 
phát triển của nấm C. sinensis. Thông số được đưa ra như sau: saccharose 53,48g/L, 
peptone 11,17g/L, KH2PO4 1,05g/L với trọng lượng sinh khối nấm C. sinensis và 
lượng Se tổng tích lũy dự đoán đạt 25,4g/L và 24343,9µg (khoảng 960,3µg/g). Kết 
quả này cao hơn so với kết quả trước khi tối ưu (23882,9µg). Điều này cho thấy môi 
trường đã được tối ưu hóa nên nấm đã thích nghi và sinh trưởng tốt trong môi trường 
có nồng độ Se cao và cơ chế chuyển hóa, hấp thụ Se cũng được cải thiện nên có khả 
năng chuyển hóa selenate tốt hơn. Sau đó, đã tiến hành kiểm tra thực nghiệm công 
thức môi trường do mô hình Box – Behnken dự đoán. Kết quả thu được như sau: 
trọng lượng sinh khối đạt 24,9g/L lệch so với dự đoán 1,65%, hàm lượng Se đạt 
1059µg/g lệch 9,3% so với dự đoán, từ đây có thể kết luận mô hình tối ưu hóa môi 
trường nuôi cấy đã được thực hiện thành công. Tóm lại, môi trường tối ưu cho nuôi 
cấy C. sinensis thu sinh khối giàu Se theo mô hình Box - Behnken gồm khoai tây 
15,0
19,3
21,2
23,0
24,9
26,7
15
5
7,5
10
12,5
(A) (B) (C)
,0
52 
200g/L, saccharose 53,48g/L, cao nấm men 4g/L, peptone 11,17g/L, KH2PO4 
1,05g/L, K2HPO4 0,5g/L, MgCl2 0,1g/L cho phép thu được 24,9g/L sinh khối C. 
sinensis và lượng Se tổng tích lũy đạt 26400,8µg (1059µg/g). 
3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 
Kết quả tối ưu hóa thành phần môi trường cho thấy hàm lượng Se cũng như 
trọng lượng sinh khối tăng đáng kể so với giai đoạn ban đầu sau khi thu nhận được 
chủng thích nghi trên Se. Nhằm tối ưu, tăng thêm khả năng tăng sản xuất sinh khối 
cũng như sự chuyển hóa Se sang dạng hữu cơ, tiến hành tối ưu hóa điều kiện nuôi 
cấy C. sinensis trong môi trường đã tối ưu. Trong nghiên cứu này 3 yếu tố cần được 
tối ưu hóa gồm: ánh sáng (trắng, xanh dương, đỏ), pH (6, 7, 8), nhiệt độ (20, 25, 
30°C), theo mô hình D-optimal với 19 nghiệm thức ở ba mức -1, 0, +1. Sự tăng trưởng 
của sinh khối nấm được đánh giá sau 10, 20, 30, và 40 ngày nuôi cấy. Nhìn chung, 
nấm đều tăng trưởng tốt và có sự khác biệt giữa các nghiệm thức trong thực nghiệm. 
Ở thời điểm sau 10 ngày nuôi cấy tĩnh trong môi trường lỏng nhận thấy ở điều kiện 
nhiệt độ 20°C, 25°C nấm sinh trưởng tốt ở tất cả các nghiệm thức, sợi nấm lan tỏa 
gần đầy bề mặt hộp, trong khi ở 30°C chỉ thấy xuất hiện vài mảng nhỏ tơ nấm. Sau 
20, 30 ngày nuôi cấy nấm C. sinensis tiếp tục tăng trưởng và hệ sợi phủ đầy bề mặt 
hộp, chủ yếu tăng bề dày của sinh khối và màu môi trường bắt đầu chuyển sang màu 
vàng sậm hoặc đỏ nâu. Sau 40 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và nhận thấy có 
sự khác biệt rõ rệt về hình thái giữa cái lô thí nghiệm như NT2, NT4, NT7, NT11, 
NT13, NT16, NT18: sinh khối phát triển không mạnh, bề mặt nhăn, lớp sinh khối 
mỏng (Phụ lục 11), đặc điểm của nấm sau thu hoạch ở các nghiệm thức trên đã được 
mô tả (Phụ lục 12). Sau 40 ngày nuôi cấy, sinh khối được thu và rửa sạch bằng nước 
cất, sau đó đem sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi, kết quả được trình bày 
trong bảng 3.7. 
Môi trường ở các nghiệm thức 1, 3, 5, 6, 12, 15, 17 tác động tốt đến sự tích lũy 
sinh khối của C. sinensis. Trọng lượng khô của sinh khối và hàm lượng Se có trong 
đó ở từng nghiệm thức được xác định (bảng 3.7, bảng 3.9). Kết quả phân tích ANOVA 
(bảng 3.8) cho thấy, mô hình có ý nghĩa thống kê (p < 0,005) với hệ số hồi quy R2 = 
0,793 > 0,75, chứng tỏ 79,30% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu dự đoán 
theo mô hình. Điều này cho thấy mô hình đủ độ chính xác cho thí nghiệm sàng lọc. 
53 
Bảng 3.7. Trọng lượng sinh khối C. sinensis ở các nghiệm thức theo D-optimal 
Nghiệm 
thức 
Nhiệt độ pH Ánh sáng 
Sinh khối (g/L) 
Thực nghiệm Mô hình 
1 20 6 Đỏ 24,00 24,45 
2 30 6 Đỏ 21,34 21,77 
3 20 8 Đỏ 22,14 23,05 
4 30 8 Đỏ 18,06 18,03 
5 20 7 Đỏ 24,7 23,75 
6 25 7 Đỏ 22,64 21,83 
7 30 7 Trắng 21,22 22,34 
8 25 6 Trắng 24,73 24,08 
9 25 8 Trắng 22,61 23,14 
10 20 6 Trắng 23,42 24,77 
11 30 6 Trắng 24,65 23,39 
12 20 8 Trắng 25,94 24,99 
13 30 8 Trắng 20,72 21,28 
14 25 8 Trắng 23,84 23,14 
15 20 6 Xanh 20,97 20,41 
16 30 6 Xanh 20,38 21,41 
17 20 8 Xanh 21,82 22,85 
18 30 8 Xanh 22,08 21,51 
19 25 7 Xanh 22,45 21,54 
Bên cạnh đó, để xác định sự tương tác của mỗi biến cho trọng lượng sinh khối 
nấm C. sinensis tối ưu, đồ thị tương tác bề mặt ba chiều được xây dựng với trục z thể 
hiện trọng lượng sinh khối và hai biến độc lập bất kỳ trục x, y và biến còn lại là các 
điều kiện ánh sáng. Quy luật của sự tương tác giữa các yếu tố được thể hiện qua hình 
3.6. 
54 
Bảng 3.8. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình D-optimal 
Biến độc lập p-value Ảnh hưởng 
Nhiệt độ 0,009 -1,095 
pH 0,283 -0,373 
Ánh sáng (Đỏ) 0,256 -0.498 
Ánh sáng (Trắng) 0,0087 1,283 
Ánh sáng (Xanh) 0,099 -0,785 
Nhiệt độ*pH 0,132 -0,584 
Nhiệt độ * Ánh sáng (Đỏ) 0,105 -0,829 
Nhiệt độ * Ánh sáng (Trắng) 0,705 -0,180 
Nhiệt độ * Ánh sáng (Xanh) 0,066 1,009 
pH* Ánh sáng (Đỏ) 0,089 -0,912 
pH* Ánh sáng (Trắng) 0,825 -0,096 
pH* Ánh sáng (Xanh) 0,065 1,009 
Kết quả phân tích Se cho thấy lượng Se trong sinh khối dao động từ 743 đến 
1415µg/g (bảng 3.9), đồng thời phân tích sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy 
bằng mô hình D-optimal cho thấy R2 của mô hình 0,29 < 0,75, sự tương thích mô 
hình rất thấp và các yếu tố không ảnh hưởng đến sự tích lũy Se trong sinh khối (bảng 
3.10). 
55 
 Bề mặt đáp ứng của sinh khối C. sinensis theo hai yếu tố. A: nhiệt độ 
và pH trong điều kiện ánh sáng trắng; B: nhiệt độ và pH trong điều kiện ánh sáng đỏ; 
C: nhiệt độ và pH trong điều kiện ánh sáng xanh 
Bảng 3.9. Hàm lượng Se ở các nghiệm thức (µg/g) 
Nghiệm 
thức 
Nhiệt độ pH Ánh sáng 
Hàm lượng selen (µg/g) 
Thực nghiệm Mô hình 
1 20 6 Đỏ 1098 989,133 
2 30 6 Đỏ 1105 1080,28 
3 20 8 Đỏ 1042 1044,8 
4 30 8 Đỏ 1283 1146,61 
5 20 7 Đỏ 1072 1016,97 
6 25 7 Đỏ 743 1065,21 
7 30 7 Trắng 1415 1254,97 
8 25 6 Trắng 1226 1204,67 
9 25 8 Trắng 1255 1102,25 
10 20 6 Trắng 1173 1105,83 
11 30 6 Trắng 1135 1303,51 
Sinh khoi
pH
N
h
iệ
t
đ
ộ
(A)
Sinh khoi
N
h
iệ
t
đ
ộ
(B)
Sinh khoi
Nhiệt độ
(C)
56 
12 20 8 Trắng 802 998,08 
13 30 8 Trắng 1086 1206,43 
14 25 8 Trắng 1186 1102,25 
15 20 6 Xanh 1016 1143,57 
16 30 6 Xanh 1252 1112,23 
17 20 8 Xanh 1159 1019,23 
18 30 8 Xanh 871 998,567 
19 25 7 Xanh 1044 1068,4 
Bảng 3.10. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình D-optimal 
Biến p-value Biến p-value 
Nhiệt độ 
0,418 Nhiệt độ * Ánh sáng (Đỏ) 0,972 
pH 
0,626 Nhiệt độ * Ánh sáng (Trắng) 0,472 
Ánh sáng (Đỏ) 
0,658 Nhiệt độ * Ánh sáng (Xanh) 0,474 
Ánh sáng (Trắng) 
0,379 pH* Ánh sáng (Đỏ) 0,481 
Ánh sáng (Xanh) 
0,703 pH* Ánh sáng (Trắng) 0,729 
Nhiệt độ*pH 
0,964 pH* Ánh sáng (Xanh) 0,684 
R2 = 0,29 
Dựa vào các phân tích, mô hình D-optimal đưa ra điều kiện nuôi cấy tối ưu 
cho nấm C. sinensis giàu Se như sau: nhiệt độ 20°C, ánh sáng trắng, pH 6,1 với điều 
kiện này, trọng lượng sinh khối và hàm lượng Se theo mô hình dự đoán đạt được lần 
lượt 24,79g/L và 1097µg/g. Sau đó, tiến hành nuôi kiểm chứng tại điều kiện như trên 
và thu được sinh khối 26,45g/L và hàm lượng Se đạt 1068µg/g. Tóm lại, điều kiện 
tối ưu cho nuôi cấy C. sinensis giàu Se theo mô hình D-optimal gồm nhiệt độ 20°C, 
ánh sáng trắng, pH 6,1 với điều kiện này, trọng lượng sinh khối và hàm lượng Se đạt 
được lần lượt 26,45g/L và hàm lượng Se đạt 1068µg/g. Từ kết quả này, đã tiến hành 
57 
nuôi cấy ở quy mô pilot 50L (theo thông số của thành phần môi trường và điều kiện 
tối ưu) để thu nhận sinh khối, các cao chiết và hợp chất giàu Se để đánh giá hoạt tính 
sinh học của chúng. 
3.2.4 Thảo luận 
Kết quả tối ưu thành phần môi trường cho thấy saccharose 53,48g/L, peptone 
11,17g/L, KH2PO4 1,05g/L là 3 yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến trọng lượng sinh khối. 
Nghiên cứu trước đây trong môi trường lên men C. sobolifera, 3 yếu tố ảnh hưởng 
đáng kể là khoai tây, KH2PO4 và peptone và với tỉ lệ tương ứng 40%, 0,4%, 0,5% đạt 
sinh khối cao nhất [47]. Một nghiên cứu khác trên chủng C. militaris cho thấy đậu 
nành, saccharose, KH2PO4 và thiamine có ảnh hưởng đến sự phát triển quả thể khi bổ 
sung selenite và quả thể đạt cao nhất với thành phần môi trường tương ứng 30g/L, 
40g/L, 1,5mgSe/L, 5µg/L [39]. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu làm giàu Se trên một 
số đối tượng khác cho thấy saccharose, peptone, khoai tây và KH2PO4 luôn được sử 
dụng trong môi trường lỏng nuôi cấy sinh khối hệ sợi nấm Cordyceps (bảng 3.11). 
Từ kết quả tương tác giữa thành phần môi trường lên trọng lượng sinh khối nấm C. 
sinensis, ngưỡng saccharose phù hợp cho nấm C. sinensis 50g/L, kết quả phù hợp với 
nồng độ saccharose cần cho sự tăng trưởng của nấm vì nếu nồng độ saccharose quá 
cao sẽ tạo thành môi trường ưu trương gây ức chế sự tăng trưởng [72]. Nhiều nghiên 
cứu trước đây trên Cordyceps nói chung và C. sinensis nói riêng mặc dù có mục tiêu 
khác nhau nhưng đa phần đều sử dụng saccharose trong quá trình nuôi cấy như nghiên 
cứu của Kim và cộng sự trên C. militaris 50g/L [31], Singh và cộng sự trên C. sinensis 
30g/L [27], Dong và cộng sự trên C. sinensis 50g/L [33], Lin và cộng sự trên C. 
guangdongensis 20g/L [34], Zhang và cộng sự trên C. militaris 3% [39], Zhu và cộng 
sự trên chủng C. gunnii 2% [73], Wang và cộng sự trên chủng C. sinensis 30g/L [74], 
Smirnov và cộng sự cũng bổ sung 30g/L [75]. 
58 
Bảng 3.11. So sánh kết quả một số nghiên cứu về thành phần môi trường 
Đối tượng Thành phần môi trường 
Sinh khối 
(g/L) 
Tác giả 
C. militaris 
C738 
Saccharose 6% (w/v), 
peptone 1% (w/v) và 
K2HPO4 0,05% (w/v) 
12,7 
Kim và cộng sự 
(2003) [31] 
C. militaris 
Saccharose 3% (w/v), khoai 
tây 20% (w/v), NaNO3 0,2% 
(w/v) và KH2PO4 0,5% (w/v) 
19,16 
Zang và cộng 
sự (2014) [39] 
C. sinensis 
Khoai tây 200g/L, glucose 
30g/L, cao nấm men 4g/L, 
KH2PO4 2g/L, MgSO4.7H2O 
1g/L, Na2SeO3 60mgSe/L 
15,14 
Zheng và cộng 
sự (2014) [38] 
Đối với peptone, đây là nguồn nitơ hữu cơ phổ biến trong các nghiên cứu nuôi 
cấy nấm, với hàm lượng peptone dao động từ 5 đến 15g/L, trong nghiên cứu này hàm 
lượng peptone theo môi trường tối ưu là 11,17g/L. Zhu và cộng sự trên chủng C. 
gunnii cho thấy peptone là nguồn nitơ tốt cho sinh khối nấm cũng như sản xuất 
polysaccharide (IPS) [73], trong nghiên cứu của Wang và cộng sự, bên cạnh cao nấm 
men, peptone (2g/L) cũng là nguồn nitơ cho lượng sinh khối C. sinensis và IPS [74], 
Smirnov và cộng sự cũng bổ sung peptone vào nuôi cấy 2g/L [75], Gang và cộng sự 
bổ sung 3%