Luận án Nghiên cứu nuôi trồng và khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh học của nấm Ophiocordyceps sobolifera

ản ứng 
với các nhóm amino: thường là các amide cơ sở, nhưng cũng có các amide thứ cấp 
(gồm proline và hydroxyproline), hoặc dẫn xuất của nhóm carboxyl (-COOH) trong 
cấu trúc amino acid. Mẫu được đo tại Trung tâm kỷ thuật tiêu chuẩn đo lường 3 
(Quatest 3) Thành phố Hồ Chí Minh. 
OPA 
FMOC
- Điều kiện phân tích mẫu: Sử dụng phương pháp Eclipse AAA 
Cột: ZORBAX Eclipse-AAA; kích thước cột: 3,5 µm 
Hệ dung môi rửa giải (Bảng 2.5): 
A: 40 mM đệm phosphate pH = 7,8 
B: Methanol/Acetonitrile/Water = 45/45/10 
57 
Bảng 2.5. Chương trình rửa giải dung môi 
Thời gian (phút) %B 
0 0 
1,9 0 
18,1 57 
18,6 100 
22,3 100 
23,2 0 
26 0 
Tốc độ dòng: 2 mL/phút 
Nhiệt độ cột: 40°C 
Detector phát hiện: DAD 
2.5.9.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định danh các 
monosaccharide từ polysaccharide 
Nguyên tắc: 
Thủy phân polysaccharide và cho qua cột sắc ký, các chất tách ra khỏi cột 
được xác định qua phổ UV (HPLC với detector UV) để định tính và định lượng 
dựa vào monosaccharide chuẩn. 
Thực nghiệm: 
Trong luận án này, phân tích HPLC được thực hiện trên máy Series 20A 
Shimadzu (Nhật), tại Phòng thử nghiệm Chất lượng sản phẩm hàng hoá - Trung tâm 
Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng Thừa Thiên Huế. 
Điều kiện phân tích hỗn hợp sản phẩm bằng HPLC: 
+ Detector: SPD-10ADVP (UV), quét ở bước sóng 254 nm 
+ Cột sắc ký C18 (tương đương với cột RP18, pha đảo) 
+ Hệ dung môi: acetic acid 1%: acetonitrile tỉ lệ 20: 80% đến 40: 60% 
+ Tốc độ pha động: 1 đến 1,5 mL/phút 
+ Nhiệt độ cột: 25°C 
+ Thể tích mẫu: 4 L 
Kiểm tra thành phần đường của mẫu PS tại Trung tâm dịch vụ phân tích Thành 
phố Hồ Chí Minh. 
58 
2.5.9.3. Phương pháp sắc ký lọc gel hiệu năng cao để xác định khối lượng phân 
tử của polysaccharide 
Nguyên tắc: 
Có rất nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử dụng để xác định khối lượng 
phân tử trung bình của các polymer thuộc PS như phương pháp sắc ký rây phân 
tử, phương pháp sắc ký lọc gel hiệu năng cao Nguyên tắc chung của các phương 
pháp là dựa vào thời gian lưu của các PS được rửa giải kết hợp với mức độ khúc 
xạ trong sắc ký. 
Thực nghiệm: 
Khối lượng phân tử của các PS được xác định bằng phương pháp sắc ký lọc gel 
hiệu năng cao với hệ thống sắc ký lỏng (GPC—Agilent 1100) tại Phòng thí nghiệm 
phân tích trung tâm, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí 
Minh. Chất chuẩn sử dụng là các phân tử pullulan có phân tử lượng khác nhau bao 
gồm: 5, 10, 20, 50, 100, 200, 400 và 800 kDa. Các chất chuẩn và PS được cho chạy 
qua cột sắc ký ultrahydrogel 500 (7,8 mm x 300 mm, 10 µm) và rửa giải với NaNO3 
0,1M pha trong nước khử ion, chạy đẳng dòng với tốc độ 1mL/phút. Nhiệt độ đầu dò 
35°C, nhiệt độ trong cột 40°C. Thể tích rửa giải được minh họa bằng đồ thị tương 
ứng với khối lượng phân tử của chúng. 
2.5.9.4. Phương pháp phân tích sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC-MS) để định 
danh monosaccharide, xác định liên kết glycoside 
Nguyên tắc: 
- Methyl hóa các nhóm –OH của PS thành –OCH3, sau đó thủy phân cắt mạch, 
khử hóa, acetyl hóa và xác định thành phần dẫn xuất monosaccharide bằng GC-MS 
(Hình 2.10). 
- Thủy phân cắt mạch dẫn xuất methyl-PS thành methyl monosaccharide, do đó 
các vị trí tạo liên kết O-glycoside sẽ tạo thành -OH tự do. 
- Khử các monosaccharide sang thành các alditol 
- Acetyl hóa: các vị trí –OH tự do của liên kết O-glycoside ban đầu sẽ bị O-
acetyl hóa, các vị trí đã bị O-methyl hóa thì không xảy ra phản ứng 
- GC-MS: xác định các dẫn xuất O-methyl O-acetyl của monosaccharide, vị trí 
nào bị acetyl hóa thì vị trí đó tạo liên kết glycoside trong PS. 
59 
Thực nghiệm: 
Quá trình thực nghiệm được trình bày trên Hình 2.8 và 2.9. 
Hình 2.8. Quy trình methyl hóa polysaccharide 
Hình 2.9. Quy trình xử lý mẫu để phân tích GC-MS 
60 
Hình 2.10. Sơ đồ methyl hoá, thuỷ phân cắt mạch, acetyl hoá 
tạo dẫn xuất alditol 
Methyl hóa 
polysaccharide 
Thủy phân polysaccharide 
tạo thành các 
monosaccharide 
Khử hóa tạo các dẫn xuất 
alditol 
Acetyl hóa các dẫn xuất 
xuất alditol 
61 
Thực nghiệm: 
Trong luận án này, phân tích GC-MS ghi trên máy GC-MS 7890A-5975C, cột 
sắc ký HP-5MS (30 m x 250 m x 0,25 m). Ngày đo mẫu 31/12/2019. Nơi đo 
mẫu: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường (Quatest 2), số 2 Ngô Quyền, Quận 
Sơn Trà, Thành phố Đà Nẵng. 
Điều kiện phân tích bằng sắc ký khí khối phổ (GC-MS): 
+ Nhiệt độ đầu cột: 45°C. 
+ Nhiệt độ buồng bơm: 250°C. 
+ Chế độ bơm: không chia dòng. 
+ Nhiệt độ nguồn ion: 200°C. 
+ Nhiệt độ bộ phận kết nối: 250°C. 
+ Mảnh ion phân tử tối thiểu (m/z): 45 và tối đa là 300. 
Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu được trình bày trong Bảng 2.6. 
Bảng 2.6. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS 
Tốc độ (°C /phút) Nhiệt độ cuối (°C) Thời gian lưu (phút) 
- 
8,00 
2,00 
65 
250 
280 
1 
1 
1 
Tổng thời gian : 20 phút 
2.5.9.5. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (FT-IR) 
Nguyên tắc: 
 Năng lượng từ tia hồng ngoại làm các liên kết trong hợp chất nghiên cứu 
dao động. Phổ hồng ngoại FT-IR biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ của hợp 
chất theo loại hạt photon của tia hồng ngoại. Dựa vào tần số đặc trưng cường độ 
trong phổ hồng ngoại, người ta có thể phán đoán trực tiếp về sự có mặt các nhóm 
chức, các liên kết xác định trong phân tử. Đồng thời từ dao động của các peak đặc 
trưng có thể xác định cấu hình α và β, hệ vòng pyran hoặc furan và liên kết 
glycoside của polysaccharide (Bảng 2.7). 
62 
Thực nghiệm: 
Xử lý mẫu: mẫu được ép viên với KBr (tỉ lệ 1mg mẫu/100mg KBr), các viên 
được tạo ra dưới lực ép khoảng 10.000 kg/m2. 
Ghi phổ: Phổ hồng ngoại đo trên máy FT-IR Prestige spectrophotometer tại 
Khoa Hóa học, Trường Đại học sư phạm Huế, Đại Học Huế. 
Bảng 2.7. Phổ FTIR của polysaccharide 
Dải hấp thụ (cm‒1) Nhóm chức đặc trưng 
3415 O-H 2015 [132] 
2926 C-H 2015 [132] 
1647 H-O-H 2013 [132] 
1400 C-O 2014 [132] 
1027 C-O-H 2014 [132] 
1041-1026 -O-C-β-D-glucan 2000 [46] 
810 Mannose 2005 [91] 
979 D-glucanpyranose 2020 [126] 
2.5.9.6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 1 3 C-NMR, DEPT) và 
hai chiều (HSQC, HMBC, COSY) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR 
Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội) tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa 
học và Công nghệ Việt Nam. 
-Phổ 1H-NMR của polysaccharide: Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide 
từ số các tín hiệu cộng hưởng proton anomer với độ chuyển dịch hóa học ở khoảng δ 
4,4-5,8 ppm. Có thể xem xét độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các 
oligonucleotide, protein hay lipid).. 
- Phổ 13C-NMR có thể định tính bộ khung cơ bản của PS. Các carbon anomeric 
số lượng các mắt xích đường trong phân tử polysaccharide. (Các tín hiệu carbon 
anomeric thường ở độ chuyển dịch hóa học ở khoảng δ 90-110 ppm). 
63 
- Phổ 1H - 1H COSY (Correlation Spectroscopy): cho thông tin sự tương tác 
giữa các proton của carbon cận kề nhau trong cấu trúc phân tử. 
- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation): cho thông tin về vị 
trí của proton nối trực tiếp với nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử. 
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation): cho thông tin về các 
tương tác giữa các proton của carbon cận kề nhau trong cấu trúc phân tử. 
64 
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Khảo sát điều kiện nuôi trồng nấm Ophiocordyceps sobolifera 
Mục tiêu của phần này là tìm được điều kiện để thu được khối lượng sinh khối 
nấm Ophiocordyceps sobolifera lớn nhất và có chứa hàm lượng các hoạt chất 
polysaccharide, hợp chất phenol và flavonoid cao nhất. Trước hết, cần nghiên cứu 
điều kiện để hình thành sợi nấm. 
3.1.1. Điều kiện hình thành và kích thước của sợi nấm 
 Tiến hành cấy giống từ ống nghiệm chứa giống gốc sang đĩa petri và nuôi 
trồng theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.5.1.1. Theo các nghiên cứu trước đây, 
ngoài dưỡng chất cung cấp trong quá trình nuôi cấy nấm, điều kiện quan trọng nhất 
quyết định việc có thể hình thành sợi nấm hay không là pH và nhiệt độ của môi trường 
nuôi cấy [86]. 
3.1.1.1. Ảnh hưởng của pH 
Nấm được cấy vào môi trường đã được cố định các yếu tố dinh dưỡng PDA 
(Potatoes, Dextrose, Agar), cố định nhiệt độ ở 25°C và điều chỉnh pH từ 5 đến 9 
bằng đệm phosphate, mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại 03 lần. Sản phẩm nấm 
thu hoạch sau 07 ngày được đem đo kích thước (đường kính) trên đĩa petri, kích thước 
sợi nấm được thể hiện trong Bảng 3.1. và minh họa trên Hình 3.1. 
Bảng 3.1. Kích thước sợi nấm trong các môi trường có pH khác nhau (n-3) 
pH Đường kính sợi nấm (mm)(*) 
5 16 ± 2 
6 53 ± 1 
7 72 ± 1 
8 65 ± 1 
9 17 ± 2 
65 
Điều kiện: môi trường dinh dưỡng PDA (Potatoes, Dextrose, Agar), nhiệt độ 25°C. 
Hình 3.1. Kích thước sợi nấm trong các môi trường có pH khác nhau (n-3) 
Phương pháp ANOVA một yếu tố (ANOVA single factor) được sử dụng để 
đánh giá sự sai khác giữa các giá trị kích thước đường kính nấm theo pH sau thời gian 
phát triển 7 ngày. Sợi nấm chỉ phát triển tốt trong khoảng pH từ 5 đến 9, môi trường 
acid hoặc base quá mạnh đều cho kích thước nấm quá nhỏ nên là điều kiện không tốt 
cho việc hình thành sợi nấm. Với mức ý nghĩa α = 0,05, kết quả cho thấy các giá trị 
đường kính nấm trong các môi trường có pH từ 5 đến 9 là khác nhau về mặt thống kê 
với F(4)= 766; p< 0,0001. Như vậy, pH của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn 
đến sự hình thành và kích thước của sợi nấm. Ở pH = 7, sợi nấm phát triển tốt nhất, 
vì vậy pH = 7 được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 
3.1.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 
 Nấm được nuôi trồng trong môi trường đệm phosphate (pH = 7) ở các điều 
kiện nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 23°C đến 30°C. Kết quả cho thấy, khi thay 
đổi nhiệt độ từ 23°C đến 25°C thì đường kính sợi nấm tăng dần (Hình 3.2 và 3.3). 
Tuy nhiên, ở nhiệt độ cao hơn 25°C thì đường kính sợi nấm lại giảm đến quá nhỏ. Vì 
vậy, nhiệt độ thích hợp để sợi nấm phát triển và có kích thước lớn là 25°C. 
10
20
30
40
50
60
70
80
4 6 8 10
K
íc
h
 t
h
ư
ớ
c 
sợ
i 
n
ấm
 (
m
m
)
pH
66 
Hình 3.2. Đường kính sợi nấm theo nhiệt độ khác nhau của phòng nuôi cấy (n=3) 
 Khi quan sát về hình thức và quá trình phát triển của sợi nấm với nhiệt độ khác 
nhau (Hình 3.3. ), cho thấy sự phát triển sợi nấm với nhiệt độ khác nhau là khác nhau. 
Nên quá trình khảo sát này rất quan trọng trong việc xác định nhiệt độ mà ở đó nấm 
có thể phát triển tốt nhất. 
Hình 3.3. Nấm nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau: (a) 23°C, (b) 25°C, (c) 29°C 
Kết quả sau khi khảo sát chọn nhiệt độ và pH thích hợp làm cho việc nuôi 
trồng nấm được phát triển tốt nhất trong điều kiện khảo sát ( Hình 3.4), sợi nấm phát 
triển đồng đều trên bề mặt và sâu xuống lớp agar trên đĩa petri. 
30
40
50
60
70
80
22 24 26 28 30
K
íc
h
 t
h
ư
ớ
c 
sợ
i 
n
ấm
 (
m
m
)
Nhiệt độ (oC)
(a) (b) (c) 
67 
Hình 3.4. Nấm mọc sau 7 ngày 
Từ đĩa petri (Hình 3.4), phân tán và cấy sợi nấm vào môi trường nuôi trồng đã chuẩn 
bị trước. Sinh khối sợi nấm thu được sau thời gian khác nhau được thể hiện ở Hình 3.5. 
Hình 3.5. Sinh khối sợi nấm Ophiocordyceps sobolifera sau thời gian khác nhau: (1) lô 
cấy sau 1 ngày, (2) lô cấy sau 5 ngày, (3) lô cấy sau 10 ngày và (4) lô cấy sau 21 ngày 
Mẫu được thu hoạch sau 21 ngày và rửa sạch bằng nước cất, sau đó tiến hành 
sấy lạnh bằng máy sấy thăng hoa Harvest Right đến khối lượng không đổi. 
Như vậy, khi được cấy trên đĩa petri trong môi trường PDA được điều chỉnh pH 
bởi đệm phosphate, ở pH = 7 và nhiệt độ 25°C, đường kính sợi nấm Ophiocordyceps 
sobolifera đạt giá trị lớn nhất (72 mm). Công trình nghiên cứu của tác giả Shoji Ohga 
[86] cũng thu được sợi nấm Ophiocordyceps sobolifera phát triển tốt ở điều kiện 
tương tự. Kết quả, của khảo sát pH, nhiệt độ nuôi trồng nấm phù hợp với những 
nghiên cứu trước đây. 
 1 2 
3 4 
68 
3.1.2. Điều kiện tách chiết và định lượng các hoạt chất polysaccharide (PS), các 
hợp chất phenol và flavonoid trong mẫu nấm 
 Mẫu nấm thu được ở điều kiện nuôi cấy trong môi trường pH =7 và nhiệt độ 
25oC được sử dụng để khảo sát điều kiện tách chiết và định lượng các hoạt chất. 
3.1.2.1. Điều kiện tách chiết và định lượng polysaccharide 
Polysaccharide được tách chiết theo nguyên tắc đã trình bày trong quy trình ở 
mục 2.5.8.1; Hình 2.6; Hình 2.7. Nồng độ PS trong dịch chiết được xác định bằng 
phương pháp phenol-sulfuric acid, chất chuẩn là D-glucose, khoảng nồng độ tuyến tính 
từ 0 đến 200 µg/mL, thu được phương trình hồi quy tuyến tính (phụ lục: Hình P1): 
[Abs] (%) = 0,0069 X + 0,0777 
 Hiệu suất chiết PS được quy về khối lượng PS thu được từ 100 g mẫu nấm 
ban đầu, được thể hiện trong Bảng 3.2. 
Bảng 3.2. Hiệu suất chiết polysaccharide ở các điều kiện khảo sát 
Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 
Điều kiện: Tỉ lệ mẫu: thể tích nước (g/mL) 1:50; thời gian 3 giờ/lần, chiết 3 lần, tỉ lệ ethanol 96°: dịch chiết (v/v) 4:1. 
Nhiệt độ chiết (°C) 60 70 80 90 100 
Hiệu suất PS 
(g/100 g mẫu) 
3,579 ± 0,088 3,985 ± 0,010 4,066 ± 0,144 4,327 ± 0,096 4,516 ± 0,099 
Ảnh hưởng của tỉ lệ khối lượng mẫu: thể tích dung môi nước 
Điều kiện: Nhiệt độ chiết 100°C; thời gian 3 giờ/lần, chiết 3 lần, tỉ lệ ethanol 96°: dịch chiết (v/v) 4:1. 
Tỉ lệ mẫu: nước (g/mL) 1:30 1:40 1:50 1:60 1:70 
Hiệu suất PS 
(g/100 g mẫu) 
4,025 ± 0,004 4,468 ± 0,044 4,521 ± 0,007 4,531 ± 0,027 4,528 ± 0,017 
Ảnh hưởng của tỉ lệ ethanol 96°: dịch chiết 
Điều kiện: Nhiệt độ chiết 100°C, tỉ lệ mẫu: thể tích nước (g/mL) 1:60, thời gian chiết 3 giờ/lần chiết, chiết 3 lần 
Tỉ lệ ethanol 96°/ dịch 
chiết (v/v) 
2:1 3:1 4:1 5:1 
Hiệu suất PS 
(g/100 g mẫu) 
2,903 ± 0,070 3,735± 0,116 4,516 ± 0,010 4,509 ± 0,090 
Ảnh hưởng của thời gian/1 lần chiết 
Điều kiện: Nhiệt độ 100°C, tỉ lệ mẫu: nước (g/.L) 1:60, chiết 3 lần, tỉ lệ ethanol 96°: dịch chiết (v/v) 4:1 
Thời gian (giờ) 2 3 4 5 6 
Hiệu suất PS 
(g /100 g mẫu) 
3,425 ± 0,014 4,248 ± 0,016 4,525 ± 0,008 4,514 ± 0,013 4,512 ± 0,002 
Ảnh hưởng của số lần chiết 
Điều kiện: Nhiệt độ 100°C, tỉ lệ mẫu: nước (g/mL) 1:60, thời gian:4 giờ/1 lần, tỉ lệ ethanol 96°: dịch chiết (v/v) 4:1 
Số lần chiết (lần) 2 3 4 5 
Hiệu suất PS 
(g/100 g mẫu) 
3,843 ± 0,012 4,215 ± 0,0,07 4,518 ± 0,013 4,509 ± 0,017 
*Xtb ± Sd, n =3. 
69 
Bảng 3.2 cho thấy, khi tăng nhiệt độ trong khoảng 60 – 100°C, hiệu suất PS chiết 
được tăng và đạt cao nhất là 4,516 0,099 g/100 g mẫu ở 100°C. Khi nhiệt độ tăng, sự 
khuếch tán của polysaccharide từ các tế bào nấm vào dung môi chiết tăng lên. Công bố 
của Chun-Hung Chiu [17] và Jike Lu [64] cũng tìm thấy nhiệt độ chiết polysaccharide 
từ loài Ophiocordyceps sobolifera được nuôi trồng tại Trung Quốc là 100°C. 
Khi thể tích dung môi tăng, hiệu suất PS thu được tăng nhanh trong khoảng tỉ 
lệ mẫu: dung môi là 1:30 đến 1:60. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thể tích dung môi, 
hiệu suất polysaccharide chiết được không tăng thêm nữa. Tỉ lệ mẫu: dung môi nước 
là 1:60 được lựa chọn để chiết polysaccharide. 
Dựa vào số liệu ở bảng 3.2 cũng cho thấy, tăng tỉ lệ ethanol 96° lên thì hiệu suất PS 
thu được cũng tăng, tỉ lệ 4:1 thì hiệu suất PS chiết được cao nhất và đạt 4,516 ± 0,010g/ 
100 g mẫu. 
Thời gian chiết tăng từ 2 đến 4 giờ, hiệu suất chiết PS tăng và đạt giá trị 4,525 
g/100 g mẫu. Tuy nhiên, khi tăng thời gian lên 5 hay 6 giờ thì lượng PS thu được bắt 
đầu giảm. Thời gian chiết kéo dài có thể đã gây ra sự thay đổi cấu trúc của 
polysaccharide, vì vậy lượng PS chiết được giảm. 
 Với 4 lần chiết, hiệu suất đã đạt đến giá trị cao nhất là 4,518 g/100 g mẫu. 
Nghiên cứu của tác giả Chun-Hung Chiu [17] trên mẫu nấm Ophiocordyceps 
sobolifera nuôi cấy tại Trung Quốc cũng nhận được hiệu suất chiết PS cao nhất sau 
4 giờ/1 lần chiết và chiết 4 lần. 
 Như vậy, điều kiện tốt nhất để chiết polysaccharide là: nhiệt độ chiết: 100°C; 
tỉ lệ mẫu: thể tích nước (g/mL) 1:60, thời gian 4 giờ/1 lần chiết, chiết 4 lần, tỉ lệ 
ethanol 96°/dịch chiết là 4/1 (v/v). 
3.1.2.2. Điều kiện tách chiết và định lượng các hợp chất phenol và flavonoid 
Các hệ dung môi thích hợp nhất để chiết các hợp chất phenol là hỗn hợp nước - 
ethanol, nước - methanol, và nước - acetone. Methanol thường được sử dụng để chiết 
các phenol có khối lượng phân tử thấp hơn, trong khi acetone và nước lại tốt cho việc 
chiết các hợp chất phenol có khối lượng phân tử cao hơn [22]. Một số công trình 
nghiên cứu trước cho thấy, hỗn hợp ethanol – nước có khả năng chiết xuất các hợp 
chất phenol tốt hơn so với methanol - nước và acetone - nước [22], [114]. Ethanol 
70 
được xem là dung môi tốt và an toàn nhất để chiết các phenol [113], cao chiết thu 
được từ hệ dung môi ethanol - nước có thể ứng dụng được đối với những mục đích 
liên quan đến an toàn thực phẩm. 
Hàm lượng tổng flavonoid trong cao chiết được xác định dựa trên đường chuẩn 
với chất chuẩn là quercetin (QE) trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 0,3 mg/mL, theo 
phương trình hồi quy tuyến tính (phụ lục: Hình P3): 
Abs =10,069x + 0,0545; R2 = 0,9956 
Hàm lượng tổng các hợp chất phenol trong cao chiết được xác định dựa trên 
đường chuẩn với chất chuẩn là gallic acid (GA) trong khoảng nồng độ từ 0,02 đến 
0,2 mg/mL, theo phương trình hồi quy tuyến tính (phụ lục: Hình P2): 
Abs =10,306x + 0,1183; R2 = 0,9995 
Hiệu suất chiết được quy tương đương số mg gallic acid từ 1 gam mẫu nấm ban 
đầu (mg GA/g). Kết quả khảo sát điều kiện chiết các hợp chất phenol được thể hiện 
trong Bảng 3.3. 
Hiệu suất chiết các hợp chất phenol giảm dần khi chiết bằng các hệ dung môi: 
ethanol 70°> ethanol 50°> ethanol 96°> ethanol 30°> nước. Hiệu suất chiết được bằng 
nước thấp hơn so với các hệ dung môi còn lại. Hiệu suất chiết các hợp chất phenol 
bằng ethanol 70° cao hơn nhưng không nhiều so với ethanol 50°. Các mẫu dược liệu 
có chứa các hợp chất phenol không chỉ có độ phân cực khác nhau, mà còn có bộ 
khung với cấu trúc lập thể rất đa dạng, do đó, tương tác giữa chúng với dung môi 
không chỉ phụ thuộc vào độ phân cực. Điều đó dẫn đến hệ dung môi có thành phần 
ethanol- nước khác nhau có khả năng chiết không giống nhau và hiệu suất chiết không 
tuyến tính với nồng độ ethanol trong dung môi. 
71 
Bảng 3.3. Hiệu suất chiết các hợp chất phenol ở các điều kiện khảo sát 
- Ảnh hưởng của dung môi chiết 
Điều kiện: Nhiệt độ chiết: 70°C; tỉ lệ mẫu/ dung môi (g/mL) = 1/50; số lần chiết: 3 lần; 
thời gian chiết: 90 phút/lần 
Dung môi chiết Nước Ethanol 30° Ethanol 50° Ethanol 70° Ethanol 96° 
Hiệu suất chiết tổng 
phenol (mg GA/g) 
10,78 ± 0,01 11,17 ± 0,02 12,19 ± 0,04 13,00 ± 0,02 11,77 ± 0,09 
Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 
Điều kiện: Ethanol 70°; tỉ lệ mẫu/ dung môi (g/mL) = 1/50; số lần chiết: 3; thời gian chiết: 90 phút/lần 
Nhiệt độ chiết (°C) 40 50 60 70 
Hiệu suất chiết tổng 
phenol (mg GA/g) 
8,14 ± 0,18 9,36 ± 0,11 10,36 ± 0,31 11,46 ± 0,21 
Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/ dung môi chiết 
Điều kiện: Ethanol 70°; nhiệt độ chiết: 70°C, số lần chiết: 3; thời gian chiết: 90 phút/lần 
Tỉ lệ mẫu/ dung môi chiết 
(g/mL) 
1:30 1:50 1:70 1:90 
Hiệu suất chiết tổng 
phenol (mg GA/g) 
11,43 ± 0,07 13,06 ± 0,03 13,02 ± 0,05 13,06 ± 0,02 
Ảnh hưởng của số lần chiết 
Điều kiện: Ethanol 70°; nhiệt độ chiết: 70°C, tỉ lệ mẫu/ dung môi (g/mL) = 1/50; thời gian chiết: 90 phút/lần 
Số lần chiết 2 3 4 
Hiệu suất chiết tổng 
phenol (mg GA/g) 
11,42 ± 0,01 13,08 ± 0,03 13,15 ± 0,01 
Ảnh hưởng của thời gian/ 1 lần chiết 
Điều kiện: Ethanol 70°; nhiệt độ chiết: 70°C, tỉ lệ mẫu/ dung môi (g/mL) = 1/50; số lần chiết: 4 
Thời gian/ 1 lần chiết 
(phút) 
30 60 90 120 
Hiệu suất chiết tổng 
phenol (mg GA/g) 
10,24 ± 0,02 11,06 ± 0,03 13,16 ± 0,18 13,09 ± 0,11 
*Xtb ± Sd, n =3. 
72 
Từ bảng 3.3, cho thấy khi tăng nhiệt độ từ 40°C đến 70°C thì hiệu suất chiết 
các chất phenol thu được tăng từ 8,14 ± 0,18 mg GA/g đến 11,46 ± 0,21 mg GA/g và 
đạt hiệu suất cao nhất là 11,46 ± 0,21 mg GA/g ở 70°C. Nhiệt độ tăng làm gia tăng 
độ khuếch tán và tăng độ hòa tan của các hợp chấ