Luận án Nghiên cứu tạo kháng nguyên Hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

Download
Trang 1
Trang 2
Trang 3
Trang 4
Trang 5
Trang 6
Trang 7
Trang 8
Trang 9
Trang 10
Tải về để xem bản đầy đủ
182 trang Hà Tiên 29/03/2024 1050
Download
Bạn đang xem 10 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu tạo kháng nguyên Hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên.
Tóm tắt nội dung tài liệu: Luận án Nghiên cứu tạo kháng nguyên Hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

lần so với các cấu trúc HA trimer và oligomer TP khác và khoảng 5–7 lần so 
với các cấu trúc HA oligomer ELP khác. 
Hình 3.24. Hàm lượng kháng nguyên HA tái tổ hợp biểu hiện trong lá thuốc lá 
3.2.6. Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA trong dịch 
chiết thô lá thuốc lá 
Điều quan trọng nhất của sự biểu hiện protein ở thực vật là hoạt tính sinh học 
của protein được duy trì. Phản ứng ngưng kết hồng cầu là một kỹ thuật để đánh giá 
khả năng HA ngưng kết các tế bào hồng cầu dựa trên sự liên kết của các vị trí axit 
sialic trên các tế bào hồng cầu gà. Kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu thể hiện trên 
Hình 3.25A cho thấy với lượng dịch protein tổng số bằng nhau, hiệu giá ngưng kết tế 
bào hồng cầu của kháng nguyên HA oligomer TP là cao nhất (64 đến 256), trong khi 
các kháng nguyên HA trimer và HA oligomer ELP chỉ đạt từ 8 đến 16. 
Đối với các kháng nguyên HA nhân tạo, kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu 
thể hiện trên Hình 3.25B cho thấy với cùng một lượng dịch protein tổng số, hiệu giá 
ngưng kết tế bào hồng cầu của HACOBRA1 (8 đến 64) cao hơn HACOBRA2 (2 đến 
86.7
502.7
69.9 85.9
630.3
80.0 83.8
607.1
78.4
5.9
110.0
5.6
0.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0
600.0
700.0
ng Hàm lượng protein tái tổ hợp/kg lá tươi
93 
4). Điều này cũng tương thích với sự biểu hiện của HACOBRA1 trimer hay oligomer 
đều cao hơn so với các dạng cấu trúc của HACOBRA2. Mặt khác, khi so sánh hiệu 
giá ngưng hết tế bào hồng cầu của các HA nhân tạo và tự nhiên dạng oligomer TP 
nhận thấy HACOBRA1 nhân tạo có hiệu giá ngưng kết hồng cầu tương đương với 
H5TG tự nhiên nhưng thấp hơn so với H5HT tự nhiên. 
Hình 3.25. Phản ứng ngưng kết tế bào hồng cầu của các kháng nguyên HA 
trong dịch chiết thô thuốc lá 
150 µg (~50 µL) dịch chiết protein tổng số của mỗi dạng protein và cây không 
chuyển gen đã được thêm vào giếng đầu tiên trên đĩa đáy c hữ V. 50 µL của bộ 
đệm PBS được sử dụng để làm đối chứng âm (-). Virus bất hoạt được sử dụng 
như là đối chứng dương (+) cho phản ứng ngưng kết hồng cầu. Sau đó, một dãy 
của hai lần pha loãng được chuyển sang giếng tiếp theo cho đến giếng cuối 
cùng. 50 µL tế bào hồng cầu gà 1% đã được thêm vào tất cả các giếng. Kết quả 
được đọc sau 30 phút ủ ở 25°C; A. Kháng nguyên HA tự nhiên; B. Kháng 
nguyên HA nhân tạo. 
94 
3.3. Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng 
cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp 
3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ cây thuốc lá bằng mITC 
Quy trình sinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ lá cây thuốc lá biến 
nạp được mô tả trên Hình 3.26. Trong đó, bước tiền xử lý dịch chiết thô đã được 
nghiên cứu để lựa chọn nồng độ PEG 8000 thích hợp nhất và các giai đoạn làm giàu 
protein đích cũng được lựa chọn để thu hồi protein đạt hiệu suất cao nhất. 
Hình 3.26. Quy trình tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP tái tổ hợp 
trong cây thuốc lá 
Lựa chọn nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch protein 
Kháng nguyên tái tổ hợp cần được tinh sạch cho những nghiên cứu đặc tính 
kháng nguyên, khả năng gây miễn dịch động vật...Trong nghiên cứu này, chúng tôi 
đưa ra phương pháp đơn giản để tinh sạch protein tái tổ hợp dựa trên sự gắn đuôi ELP 
vào protein. Sự chuyển pha nghịch đảo của protein gắn ELP phụ thuộc vào nhiệt độ 
và nồng độ muối. Sự tăng nồng độ muối và nhiệt độ dẫn đến sự hình thành các protein 
95 
không tan, những phân tử protein này sẽ được tách ra khỏi dung dịch bằng ly tâm ở 
nhiệt độ nhất định. Protein gắn ELP không tan sẽ được hòa tan lại bằng đệm lạnh 
nồng độ ion thấp. Nguyên nhân gây ra sự chuyển pha nghịch đảo là do sự hình thành 
các khối kết tụ kích thước nhỏ của protein gắn ELP. Những khối kết tụ này có thể 
được gắn trên màng. Đây là cơ sở cho thí nghiệm tinh sạch HA oligomer ELP của 
các chủng virus cúm A/H5N1 (H5N1: clade 2.3.2.1c và clade 1.1) bằng màng lọc dựa 
trên sự chuyển pha nghịch đảo (mITC). 
Hình 3.27. Kết quả ly tâm loại bỏ tạp chất sử dụng PEG 8000 ở các nồng độ 
khác nhau 
Tuy nhiên, trong quá trình tinh sạch qua màng ES 0,2 µm khi cho dịch protein 
trong muối NaCl 2M ở nhiệt độ thường dịch không đi được qua màng. Nguyên nhân 
là do có quá nhiều protein tạp chưa bị loại ở các bước li tâm và qua màng PES 0,22 
µm. Vì vậy, để loại bớt protein tạp chúng tôi đã bổ sung PEG 8000 vào dịch protein 
sau khi li tâm. Nồng độ PEG đã được tối ưu nhằm thu lại được nhiều HA nhất và ít 
tạp nhất. Quy trình này cũng có thể được áp dụng tinh sạch protein gắn ELP từ lá cây 
chuyển gen nhằm giảm bước ly tâm tốc cao để thu dịch chiết sạch cho bước tinh sạch 
mITC tiếp theo. Để loại bớt protein tạp chúng tôi đã bổ sung PEG 8000 vào dịch 
protein tiền xử lý thu được sau khi ly tâm ở bước 1 của quy trình tinh sạch. Nồng độ 
PEG đã được tối ưu nhằm thu lại được nhiều HA nhất và ít tạp nhất. Các nồng độ của 
PEG được thử nghiệm từ 0, 8, 10, 12, 14 và 20% được bổ sung vào dịch chiết thực 
vật tiền xử lý. Hỗn hợp sau đó được ly tâm 13000 v/p ở 4oC trong 30 phút. Dịch nổi 
chứa protein hòa tan được sử dụng để điện di và phát hiện bằng phản ứng lai miễn 
dịch và nhuộm Coomassie Brilliant Blue. 
96 
Kết quả ly tâm loại cặn được thể hiện ở Hình 3.27 cho thấy việc sử dụng PEG 
8000 giúp loại bỏ các tạp chất hòa tan trong dịch chiết hiệu quả hơn so với việc không 
sử dụng PEG8000. 
A B 
Hình 3.28. Kết quả phân tích protein trong dịch nổi bằng lai miễn dịch (A) 
và nhuộm Coomassie Brilliant Blue (B). 
Kết quả tối ưu nồng độ PEG đã thu được hàm lượng protein cao nhất khi sử 
dụng nồng độ PEG 8–10%, bởi tại nồng độ này protein đích vẫn còn trong dịch nổi 
trong khi tạp chất đã bị loại bỏ (Hình 3.28). Vì vậy, lựa chọn nồng độ PEG 8000 9% 
nằm giữa khoảng 8–10% để sử dụng cho các thí nghiệm tinh sạch các protein HA 
oligomer ELP. 
Lựa chọn giai đoạn làm giàu protein tinh sạch 
Hình 3.29. Cải tiến quá trình tinh sạch mITC bởi PEG. 
Dịch chiết thực vật có chứa NaCl (2M) có và không có PEG 8000 (9%) được 
sử dụng cho mITC với 4 vòng khác nhau. Các thể tích tương đương (40 µL) 
của các protein pha tan được phân tích bởi SDS-PAGE và phát hiện bằng 
nhuộm Coomassie. 
Plant extract + PEG 8000
0 8 10 12 14 20%
170
130
95
72
55
43
34
Plant extract + PEG 8000
0 8 10 12 14 20%
A B
97 
Sử dụng dịch chiết nồng độ PEG 8000 với nồng độ đã được tối ưu ở trên (9%) 
để làm giàu protein ở bước tinh sạch tiếp theo. NaCl được bổ sung vào dịch chiết pha 
trên có và không có PEG 8000 (9%). Dung dịch tiếp đó được sử dụng cho quá trình 
tinh sạch qua màng mITC với bốn vòng mITC khác nhau. Protein đích được hòa tan 
và phát hiện bởi nhuộm Coomassie. Hình 3.29 cho thấy quá trình làm giàu protein 
đích sau vòng mITC thứ nhất có PEG, trong khi protein đích phân bố tương đương 
nhau trong mỗi vòng của mITC khi không sử dụng PEG. Kết quả cho thấy PEG 8000 
không chỉ giúp loại bỏ tốt các tạp chất trong dịch chiết thực vật mà còn tăng cường 
hiệu quả bám của protein H5pII-ELP trên màng. 
Hiệu suất thu hồi kháng nguyên HA bằng mITC 
Hình 3.30. mITC dựa vào PEG để tinh sạch các protein HA oligomer ELP 
Dịch chiết thực vật có chứa NaCl (2M) có và không có PEG 8000 (9%) được 
sử dụng cho quy trình mITC. Protein được phân tích trên SDS -PAGE và phát 
hiện bằng cách nhuộm Coomassie Brilliant Blue (A) hoặc Western blot (B, C) ; 
M. Thang protein chuẩn; RE. Dịch chiết thô chứa protein HA trước xử lý; Sm . 
dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng cellulose acetate (CA) 0,2 
µm ở nhiệt độ phòng; Pm. protein HA được hoà tan tách khỏi màng bằng nước 
để lạnh. 
Sau khi đã tìm được những điều kiện thích hợp nhất cho tinh sạch kháng 
nguyên HA ELP hoá bằng mITC, quy trình này được sử dụng để tinh sạch các kháng 
98 
nguyên HA nghiên cứu khác. Kết quả thể hiện trên Hình 3.30A cho thấy lượng protein 
thu được tương đối lớn. Các mẫu sau mỗi bước tinh sạch gồm dịch chiết thô trước 
xử lý (RE), dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng (Sm) và dịch tinh 
sạch protein tách rửa khỏi màng bằng nước lạnh (Pm) đều cho thấy kháng 
nguyên tái HA tổ hợp ELP hoá đã được giữ lại một cách chọn lọc trên màng 
trong khi các protein khác đi qua khỏi màng thể hiện ở một băng vạch duy nhất 
tương ứng với kích thước chính xác của HA oligomer ELP và các vạch băng 
protein giống nhau giữa dịch thô và dịch đi qua màng trừ băng tương ứng với 
kích thước protein HA tái tổ hợp ELP hoá bị đứt gãy (dưới 55 kDa). Gel nhuộm 
Coomassie Brilliant Blue cũng cho thấy protein H5TG oligomer ELP được tinh 
sạch bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch và nồng độ cao. Hiệu suất thu 
hồi protein HA oligomer ELP tái tổ hợp đạt khoảng 94,98–96,04% (Bảng 3.5). 
Điều này chứng tỏ rằng quy trình tinh sạch protein HA dung hợp ELP bằng sử dụng 
màng mITC là một quy trình đơn giản, hiệu quả cao, có thể mở rộng và ít tốn thời 
gian, đặc biệt là có thể tránh được sự suy thoái của các kháng nguyên cúm tái tổ hợp 
do proteinase thực vật gây ra. 
Bảng 3.5. Hiệu suất thu hồi các kháng nguyên HA oligomer ELP 
STT Protein tái tổ hợp Hiệu suất tinh sạch (%) 
1 H5TG 94,98 
2 H5HT 95,04 
4 HACOBRA1 95,05 
5 HACOBRA2 96,04 
3.3.2. Tinh sạch kháng nguyên HA trimer và oligomer TP bằng IMAC 
Để phát hiện chính xác chức năng và cấu trúc của các protein HA nghiên cứu, 
dịch chiết xuất thô của mỗi protein HA đã được sử dụng cho phương pháp tinh chế 
bằng IMAC. IMAC là một phương pháp thường được sử dụng để tinh chế các protein 
tái tổ hợp có chứa amino acid polyhistidine dựa trên sự tương tác đặc hiệu mạnh giữa 
các amino acid này và các ion kim loại cố định (Co2+, Ni2+, Cu2+ và Zn2+) [140]. 
99 
Để thu được protein HA từ lá N. benthamiana, các protein được dung hợp đuôi 
histidine 6x ở vùng đầu C. Dịch chiết thuốc lá có chứa protein HA sau đó được ủ với 
Ni-NTA agarose. Các protein HA có chứa các đuôi histidine sẽ được giữ lại một cách 
hiệu quả trên cột agarose IMAC. Ở các bước rửa và hoà tan protein ra khỏi cột IMAC, 
imidazole với các nồng độ khác nhau đã được sử dụng. Đối với H5TG, nồng độ 
imidazole 30 và 125 mM lần lượt được sử dụng cho bước rửa và hoà tan protein. 
Trong khi, khảo sát với HACOBRA1 thì nồng độ này lần lượt là 5 và 50 mM. 
Hình 3.31. Tinh sạch H5TG trimer và oligomer TP bằng IMAC 
Protein trong dịch chiết thô (crude extract, CE), dịch qua cột (Flow through , 
FT), dịch rửa (washing, W) và dịch hoà tan protein (elution, E) được bổ sung 
lên mỗi đường chạy cho phân tích SDS-PAGE 10% biến tính, nhuộm 
commassie blue (A, C) và Western blot sử dụng kháng thể anti-c-myc và phát 
hiện bằng kit ECL (B, D); M. Thang protein chuẩn. 
Hình 3.32. Tinh sạch HACOBRA1 trimer bằng IMAC. 
Protein trong dịch chiết thô (CE), dịch qua cột (FT), dịch rửa (W) và dịch hoà 
tan protein (E) được bổ sung lên mỗi đường chạy cho phân tích SDS -PAGE 
10% biến tính, nhuộm commassie blue (B) và Western blot sử dụng kháng thể 
anti-c-myc và phát hiện bằng kit ECL (A, C) ; Một seri các nộng độ imidazole 
(30, 25, 20 và 5 mM tương ứng với dịch rửa W30, W25, W20 và W5) được 
kiểm tra ở bước rửa (A). Cuối cùng W5 là nồng độ tối ưu nhất của imidazole 5 
100 
mM được lựa chọn cho tinh sạch HACOBRA1 trimer (B, C). 50 ng của H5TG 
trimer tinh sạch bằng SEC sử dụng làm đối chứng dương (+). 
Kết quả tinh sạch các protein H5TG trimer, H5TG oligomer TP và 
HACOBRA1 trimer được thể hiện trên Hình 3.31 và Hình 3.32 cho thấy các protein 
HA thu được rất tinh khiết rất rõ ràng và sạch sẽ, và chúng dường như không bị loại 
bỏ qua dòng chảy qua và rửa các bước. 
3.3.3. Trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng 
nguyên HA sau tinh sạch 
Bằng SDS-PAGE ở điều kiện không biến tính, đặc tính cấu trúc trimer và 
oligomer của kháng nguyên H5TG tinh sạch cũng được xác định và phát hiện thông 
qua phương pháp lai miễn dịch dựa trên kháng thể đơn dòng anti-c-myc (Hình 3.33A). 
Cụ thể, kích thước của kháng nguyên H5TG trimer khoảng 200 kDa, trong khi của 
kháng nguyên H5TG oligomer TP và H5TG oligomer ELP lần lượt hơn 210 kDa và 
hơn 260 kDa. Ngoài ra, đặc tính chức năng của kháng nguyên H5TG tinh sạch cũng 
được xác định bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu như trong Hình 3.33B. Trong đó, 
chỉ với 0,06 μg kháng nguyên H5TG oligomer TP tinh khiết có thể ngưng kết các tế 
bào hồng cầu, trong khi của kháng nguyên H5TG trimer tinh khiết và H5TG oligomer 
ELP tinh khiết là 0,24 μg. Kháng nguyên H5TG oligomer TP có đặc tính ngưng kết 
tế bào hồng cầu mạnh hơn so với hai kháng nguyên còn lại. Kết quả tương tự cũng 
nhận được khi phân tích cấu trúc và chức năng của các kháng nguyên H5HT. 
A B 
Hình 3.33. Đặc điểm cấu trúc và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng 
nguyên H5TG tinh sạch 
Các kháng nguyên H5TG tinh sạch được phát hiện bằng SDS-PAGE ở điều 
kiện không biến tính trên gel polyacrylamide 10% và Western blot ( A) và hoạt 
101 
tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên H5TG đã tinh sạch (B); (+). 
Đối chứng dương (+) là virus A/H5N1 bất hoạt; ( -). Đối chứng âm là đệm PBS. 
HA trimer chứa các epitope có thể tạo ra các kháng thể trung hòa; do đó, điều 
quan trọng là duy trì được dạng HA trimer ổn định. Trong nghiên cứu này, motif 
trimer hoá (GCN4-pII) đã được sử dụng để sản xuất protein HA homotrimer hoá ổn 
định. Các trạng thái trimer hoá của protein HA tinh sạch bởi IMAC đã được xác định 
bằng phản ứng liên kết chéo sử dụng BS3, một cầu nối hòa tan trong nước và đồng 
chức năng sinh học [141, 142]. Phân tích bởi SDS-PAGE biến tính và Western blot 
chỉ ra rằng kháng nguyên HACOBRA1 trimer nhân tạo tái tổ hợp và kháng nguyên 
H5TG trimer tự nhiên được quan sát dưới dạng hỗn hợp của trimeric (∼201,45 kDa), 
dimeric (∼134,3 kDa) và monomeric (∼67,15 kDa) nếu không sử dụng BS3 (như 
trong Hình 3.34B- đường chạy số 1, 3). Khi bổ sung BS3 vào HA trimer thì đã thu 
nhận được một băng vạch protein duy nhất ở dạng trimer trên bản Western blot (như 
trong Hình 3.34B- đường chạy số 2, 4). Những kết quả này tương tự như nghiên cứu 
của Weldon và các đồng nghiệp. Kết quả này chỉ ra rằng việc dung hợp GCN4-pII 
vào protein HA ở đầu C đã làm ổn định cấu trúc trimer của protein HA tái tổ hợp 
được tạo ra trong thực vật [91]. Bằng phương pháp liên kết chéo sử dụng BS3 này, 
các cấu trúc trimer và oligomer của kháng nguyên H5HT cũng đã được chứng minh 
như mô tả trên Hình 3.34C và D. 
Hình 3.34. Hoạt tính ngưng kết hồng cầu (A) và trạng thái oligomer hoá (B, C, D) 
của các kháng nguyên HACOBRA1, H5TG và H5HT tinh sạch 
102 
Các kháng nguyên HA tái tổ hợp tinh sạch liên kết (+) và không liên kết (-) với 
BS3 được bổ sung lên giếng để chạy SDS -PAGE 10% ở điều kiện biến tính và 
phát hiện bởi Western blot sử dụng anti-cmyc antibody và phân tích ECL. 
Các kết quả tương tự cũng thu được khi mô tả trạng thái oligomer hoá của 
protein HACOBRA1 trimer nhân tạo và H5TG trimer tự nhiên tinh sạch thông qua 
sắc kí lọc gel (size exclusion chromatography, SEC) như biểu diễn trong Hình 3.35. 
Các protein HA nằm trong các phân đoạn từ A11 đến B7, trong đó hầu hết các kháng 
nguyên HA nằm ở phân đoạn B1 đến B6 là các phân đoạn chứa protein tiêu chuẩn có 
khối lượng phân tử cao (160–500 kDa). Kết quả này chỉ ra rằng hầu hết các protein 
H5 tinh sạch là trimer. Các protein HA trimer tinh sạch từ các phân đoạn B1 đến B6 
đã được thu nhận và sau đó được sử dụng cho ELISA và Western blot nhằm phát hiện 
việc sản sinh kháng thể IgG chuột hoặc IgY gà đặc hiệu HA ở động vật thí nghiệm. 
Hình 3.35. Đặc điểm cấu trúc của các kháng nguyên H5TG trimer và 
HACOBRA1 trimer tinh sạch bởi SEC. 
Phân đoạn A9–B9 được phân tích SDS–PAGE 10% biến tính và Western blot 
sử dụng kháng thể kháng c–myc. 
103 
3.4. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp 
trên động vật thí nghiệm 
Trong nội dung nghiên cứu này, luận án xin trình bày những kết quả đánh giá 
tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên HA tái tổ hợp trên chuột và gà thí nghiệm. 
Những kháng nguyên HA tái tổ hợp có sự biểu hiện cao trong thuốc lá sẽ là đối tượng 
được lựa chọn cho thí nghiệm này. Các kháng nguyên HA tinh sạch dạng trimer, 
oligomer ELP và oligomer TP được đánh giá tính sinh miễn dịch trên chuột và khả 
năng bảo hộ trên gà thí nghiệm. Sau đó, hai dịch chiết thô thuốc lá chứa kháng nguyên 
H5HT trimer và oligomer TP được lựa chọn tiếp để đánh giá khả năng bảo hộ trên 
gà. 
3.4.1. Miễn dịch trên chuột thí nghiệm 
Trong thí nghiệm miễn dịch trên chuột (như được mô tả như trong Hình 3.36), 
luận án đã thử nghiệm với 9 nhóm kháng nguyên và 1 nhóm đối chứng âm là đệm 
PBS. Mỗi con chuột được tiêm ba lần với 2,5 µg kháng nguyên HA tinh sạch mỗi lần. 
Sau tiêm lần 2 và 3 huyết thanh của chuột đã được thu nhận để phân tích kháng thể 
IgG đặc hiệu HA bằng ELISA gián tiếp (Hình 3.37). 
Hình 3.36. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên chuột thí nghiệm 
Kết quả phân tích ELISA với nhóm tiêm kháng nguyên HA tự nhiên cho thấy, 
các nhóm kháng nguyên HA oligomer TP (nhóm 2 H5TG oligomer TP và nhóm 7 
104 
H5HT oligomer TP) có khả năng sinh kháng thể IgG đặc hiệu HA mạnh hơn một 
cách có ý nghĩa (giá trị P<0,05) so với các kháng nguyên nhóm HA trimer (nhóm 1 
H5TG trimer và nhóm 6 H5HT trimer) và so với nhóm kháng nguyên HA oligomer 
ELP (nhóm 3 H5TG oligomer ELP và nhóm 8 H5HT oligomer ELP) sau cả hai và ba 
lần tiêm. Các nhóm kháng nguyên HA oligomer ELP (nhóm 3 và nhóm 8) không có 
sự sai khác nhiều so với nhóm 1 H5TG trimer với giá trị P>0,05 nhưng lại thấp hơn 
có ý nghĩa so với nhóm 6 H5HT trimer sau ba lần tiêm. Điều này chứng tỏ H5HT 
trimer có khả năng sinh kháng thể IgG đặc hiệu HA mạnh hơn H5TG trimer. Việc 
dung hợp ELP vào HA không làm tăng tính sinh miễn dịch của HA. 
Hình 3.37. ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu HA trong 
huyết thanh chuột ở độ pha loãng huyết thanh 16 x 10-3 
Có 10 nhóm thí nghiệm được gây miễn dịch lên chuột. Năm huyết thanh riêng 
lẻ trong mỗi nhóm được xác định và so sánh bằng phân tích t-test. Dấu chấm 
là giá trị trung bình 4 lần ELISA lặp lại của mỗi con với độ lệch chuẩn được 
105 
biểu thị dưới dạng thanh dọc, và chuẩn độ trung bình hình học là thanh ngang 
cho mỗi nhóm thử nghiệm. 
Phân tích ELISA với nhóm kháng nguyên HA nhân tạo cho thấy, nhóm 5 
HACOBRA1 oligomer ELP và nhóm 9 HACOBRA2 oligomer ELP không có sự
File đính kèm:
luan_an_nghien_cuu_tao_khang_nguyen_hemagglutinin_ha_tai_to.pdf
02_HV_Tóm tắt luận án_Tiếng Anh.pdf
03_HV_Tóm tắt luận án_Tiếng Việt.pdf
04_HV_Đóng góp mới.doc
04_HV_Đóng góp mới.pdf
06_HV_Trích yếu luận án.doc
06_HV_Trích yếu luận án.pdf