Luận án Thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin, Niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus schum. et thonn., euphorbiaceae)

 
Cao ethanol 30 % 1,45 0,52 0,59 0,61 
Cao ethanol 40 % 0,83 0,30 0,40 0,42 
Cao ethanol 50 % 1,17 0,43 0,59 0,61 
Cao ethanol 60 % 0,91 0,32 0,43 0,45 
Cao ethanol 70 % 0,77 0,28 0,38 0,39 
Cao nước 0,18 0,04 0,04 0,03 
Cao giàu lignan điều chế 8,37 0,91 1,29 1,12 
Nhận xét: Hàm lượng phyllanthin cao nhất so với các lignan còn lại ở tất cả 
các mẫu cao khô dược liệu. Cao giàu lignan điều chế được có hàm lượng lignan cao 
và ethanol 30 % là dung môi thích hợp nhất để chiết xuất cao ở quy mô lớn. 
3.4. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO 
CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 
3.4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời phyllanthin, 
hypophyllanthin và niranthin trong huyết tương thỏ 
3.4.1.1. Khảo sát điều kiện khối phổ 
 Điều kiện khối phổ tối ưu đã được xác định như sau: Nguồn ion hóa ESI; Kiểu 
ion hóa ESI (+); Tốc độ dòng khí phun (nitơ) – Nebulizing Gas Flow: 3 L/phút; Tốc 
độ dòng khí khô (nitơ) – Drying Gas Flow: 15 L/phút; Nhiệt độ hóa hơi dung môi – 
102 
DL Temperature: 250 oC; Nhiệt độ buồng ion hóa – Heatblock Temperature: 400 oC; 
Áp suất khí phun: 25 psi; Chế độ ghi phổ: MRM; Điện thế mao quản: 4500 V; Thời 
gian chờ ghi nhận tín hiệu – Dwell time: 100 ms; Thế phân mảnh: ở Bảng 3.46. 
Bảng 3.46. Thế phân mảnh của các chất khảo sát 
Chất ESI m/z 
Q1 
(eV) 
CE 
(eV) 
Q3 
(eV) 
Tỷ 
lệ 
(%) 
Phyllanthin (PLT) (+) 436,00 → 151,10 -22 -33 -29 100 
Hypophyllanthin (HPL) (+) 261,20 → 231,10 -18 -14 -16 100 
Niranthin (NRT) (+) 449,95 → 369,20 -23 -18 -25 100 
Diazepam (+) 285,00 → 154,05 -21 -28 -30 100 
Carbamazepin (+) 237,15 → 193,10 -12 -35 -19 100 
3.4.1.2. Khảo sát chuẩn nội 
Kết quả trình bày ở Bảng 3.47 cho thấy diazepam có hiệu suất chiết cao hơn 
so với carbamazepin. Do đó, diazepam được dùng làm chuẩn nội để khảo sát phương 
pháp. 
Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu giả lập chứa các chất phân tích và các chuẩn nội khảo sát 
ở cùng nồng độ 1 g/mL 
 Bảng 3.47. Hiệu suất chiết của các chất chuẩn nội đã khảo sát 
Mẫu 
Hiệu suất chiết (%) 
Diazepam Carbamazepin 
1 87,63 48,53 
2 85,82 52,36 
3 85,93 54,65 
4 83,96 55,36 
5 90,91 52,69 
6 91,81 51,30 
Trung bình 87,68 52,48 
RSD % 3,53 4,67 
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
325000
350000
C
ar
b
am
az
ep
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
103 
3.4.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký 
Khảo sát cột sắc ký: Kết quả khảo sát cho sắc ký đồ thu được ở Hình 3.31. 
(a) 
Gemini C18 (100 × 3 mm; 5 µm) 
(b) 
Gemini C18 (100 × 2 mm; 3 µm) 
(c) 
Gemini C18 (50 × 3 mm; 5 µm) 
Hình 3.31. Sắc ký đồ khảo sát cột với các kích thước khác nhau 
Các cột sắc ký trên đều cho các pic có hình dạng khá cân xứng, tương đối tách 
nhau. Tuy nhiên, cột (a) cho tổng thời gian phân tích dài (17 phút); cột (b) và (c) cho 
thời gian phân tích ngắn hơn (10 phút và 9 phút). Mặt khác, pic diazepam (IS) có hệ 
số đối xứng As > 1,5 khi sử dụng cột (c). Kết quả chi tiết được trình bày trong Bảng 
3.48. Do đó, cột (b) Gemini C18 (100 × 2 mm; 3 µm) được sử dụng để khảo sát tiếp. 
Bảng 3.48. Kết quả khảo sát cột sắc ký 
Cột 
Diazepam Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin Tổng 
thời 
gian 
phân 
tích 
tR 
(phút) 
As tR 
(phút) 
As tR 
(phút) 
As tR 
(phút) 
As 
(a) 6,12 1,33 11,12 1,17 9,89 1,15 14,23 1,23 17 phút 
(b) 3,72 1,28 6,75 1,17 5,88 1,13 8,52 1,27 10 phút 
(c) 3,55 1,63 6,19 1,14 5,25 1,20 8,01 1,39 9 phút 
 Khảo sát pha động 
 Khảo sát hệ pha động chứa methanol hoặc acetonitril 
Methanol Acetonitril 
Hình 3.32. Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động chứa methanol hoặc acetonitril 
Nhận xét: Hệ pha động chứa acetonitril cho các pic hình dạng chưa cân xứng, tín hiệu 
thấp hơn rất nhiều so với hệ pha động chứa methanol, đặc biệt là HPL. Do đó, 
methanol được lựa chọn để khảo sát tiếp. 
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 min
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
120000
130000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
104 
Bảng 3.49. Kết quả khảo sát hệ pha động chứa methanol hoặc acetonitril 
Chất phân tích 
Methanol Acetonitril 
tR (phút) Spic 
As tR (phút) Spic 
As 
Phyllanthin 6,53 4282396 1,113 2,94 3026438 1,236 
Hypophyllanthin 5,87 1552769 1,086 2,95 6227 1,149 
Niranthin 8,50 3905449 1,098 3,43 963495 1,196 
Diazepam 3,70 2048373 1,146 2,09 151294 2,791 
Khảo sát 2 loại dung dịch đệm amoni acetat và amoni format 
(a) Amoni acetat 5 mM (b) Amoni format 5 mM 
(c) Amoni acetat 10 mM (d) Amoni format 10 mM 
Hình 3.33. Sắc ký đồ khảo sát loại đệm trong pha động 
Nhận xét: Không có sự khác biệt về thời gian lưu giữa 2 hệ pha động chứa 
amoni acetat và amoni format. Tuy vậy, có sự khác biệt đáng kể về tín hiệu (diện tích 
pic) giữa hai loại đệm này. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.50. 
Bảng 3.50. Kết quả so sánh loại đệm trong pha động 
Chất phân tích 
Đệm amoni acetat Đệm amoni format 
5 mM 10 mM 5 mM 10 mM 
tR 
(phút) 
Spic 
tR 
(phút) 
Spic 
tR 
(phút) 
Spic 
tR 
(phút) 
Spic 
Phyllanthin 6,44 4351546 6,45 2716083 6,47 5928736 6,59 5685619 
Hypophyllanthin 5,81 903801 5,82 559611 5,82 1061211 5,93 1030377 
Niranthin 8,42 2969132 8,43 1738145 8,43 3932514 8,63 3705071 
Diazepam 3,69 1197316 3,70 726776 3,69 1955434 3,73 1900661 
Nhận xét: So sánh hệ pha động chứa 2 loại đệm khảo sát cho thấy hệ pha động 
chứa amoni format cho tín hiệu các chất phân tích cao hơn hẳn so với hệ pha động 
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
105 
chứa amoni acetat. Do đó, hệ pha động chứa amoni format được sử dụng để khảo sát 
tiếp. 
Khảo sát nồng độ dung dịch đệm: Kết quả được trình bày ở Bảng 3.51. 
Bảng 3.51. Kết quả khảo sát nồng độ đệm amoni format 
mM 
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic Hệ số bất đối 
PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ 
2 6,55 5,88 8,54 3,71 4101641 1130968 4291135 2067519 1,09 1,08 1,11 1,57 
3 6,57 5,90 8,55 3,72 4037553 1173236 4223153 2148394 1,07 1,08 1,11 1,58 
5 6,56 5,90 8,55 3,71 4012826 1171779 4251618 2138989 1,10 1,10 1,10 1,18 
7 6,55 5,89 8,55 3,71 4051073 1180965 4179302 2158038 1,11 1,12 1,08 1,18 
8 6,54 5,89 8,52 3,70 4042365 1184510 4271755 2180061 1,12 1,07 1,13 1,16 
10 6,56 5,89 8,54 3,71 4253216 1183690 4309455 2229543 1,10 1,11 1,11 1,20 
Nhận xét: Khi nồng độ dung dịch đệm thay đổi, thời gian lưu các pic và tín 
hiệu (diện tích pic) không đổi. Tuy nhiên khi nồng độ amoni format dưới 5 mM thì 
pic diazepam (IS) mất cân xứng (As > 1,5). Ngoài ra, nồng độ dung dịch đệm càng 
cao thì càng có nguy cơ gây ô nhiễm nguồn ion trong quá trình phân tích, đặc biệt 
trong các đợt phân tích với số lượng mẫu nhiều. Do đó, dung dịch đệm amoni format 
5 mM đã được chọn lựa để khảo sát tiếp. 
Khảo sát pH dung dịch đệm: Kết quả trình bày ở Bảng 3.52 và Hình 3.34. 
(a) pH 3,0 
(b) pH 4,0 
(c) pH 5,0 
(d) pH 6,0 
(e) pH 7,0 
(f) Không chỉnh pH 
Hình 3.34. Sắc ký đồ khảo sát pH của dung dịch đệm amoni format 5 mM 
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
325000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
325000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
106 
Bảng 3.52. Kết quả khảo sát pH dung dịch đệm amoni format 5 mM 
pH 
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic Hệ số bất đối 
PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ 
3 6,56 5,86 8,59 3,70 4211926 1025145 4121554 2123215 1,01 1,03 1,20 1,14 
4 6,54 5,92 8,59 3,73 4235689 992505 4155213 1931451 1,18 1,10 1,16 1,25 
5 6,55 5,91 8,52 3,78 4136549 1121355 4015468 2126955 1,18 1,14 1,25 1,18 
6 6,52 5,86 8,51 3,79 4123145 1145214 4054564 2015456 1,11 1,18 1,18 1,05 
7 6,58 5,82 8,50 3,80 4121355 995215 4212135 2015645 1,04 1,21 1,18 1,18 
- 6,52 5,81 8,51 3,72 4316565 1211231 3912155 1902151 1,10 1,07 1,08 1,16 
Nhận xét: Không có sự khác biệt đáng kể về thời gian phân tích, tín hiệu và 
hình dạng pic với các pH dung dịch đệm khác nhau. Do đó, dung dịch đệm (f) – amoni 
format 5 mM (không chỉnh pH) được lựa chọn để đơn giản hóa trong quá trình chuẩn 
bị pha động cho phân tích. 
Khảo sát tỉ lệ pha động: Kết quả trình bày ở Hình 3.35. 
(a) Tỉ lệ (65 : 35) (b) Tỉ lệ (63 : 37) (c) Tỉ lệ (60 : 40) 
Hình 3.35. Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động 
Nhận xét: Khi tăng thành phần methanol trong pha động, các pic xuất hiện 
sớm hơn. Tuy nhiên, với tỉ lệ (a) (65 : 35) thì pic PLT và HPL chưa tách hoàn toàn, 
xen phủ với nhau. Với tỉ lệ (c) (60 : 40), mặc dù các pic tách nhau hoàn toàn nhưng 
thời gian phân tích dài (14 phút). Do đó, hệ pha động với tỉ lệ (b) (63 : 37) đã được 
lựa chọn vì cho thời gian phân tích phù hợp (10 phút) và các pic tách nhau hoàn toàn. 
Khảo sát nhiệt độ cột: Kết quả trình bày ở Bảng 3.53 và Hình 3.36. 
Bảng 3.53. Thông số sắc ký của chất phân tích, chuẩn nội với nhiệt độ cột khảo sát 
to 
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic Hệ số bất đối 
PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ 
30 6,98 6,20 9,15 4,20 4100213 1236266 4123126 2026669 1,17 1,05 1,08 1,14 
35 6,89 6,12 8,89 4,05 4215365 1036126 4015615 1951163 1,12 1,13 1,25 1,25 
40 6,52 5,95 8,56 3,77 4321352 1155312 3951548 1914521 1,17 1,18 1,06 1,28 
45 6,10 5,55 8,15 3,58 4049648 1051456 3911455 1816361 1,11 1,18 1,04 1,66 
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
107 
Hình 3.36. Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ cột 
Nhận xét: Khi nhiệt độ cột tăng từ 30-45 oC, tín hiệu của các chất phân tích 
gần như không thay đổi, các pic xuất hiện sớm hơn. Khi nhiệt độ trên 40 oC, pic 
diazepam mất cân đối (As > 1,5). Do vậy, nhiệt độ cột 40 oC được lựa chọn vì thời 
gian phân tích phù hợp và cho hình dạng pic cân xứng. 
Khảo sát tốc độ dòng: Kết quả trình bày ở Bảng 3.54 và Hình 3.37. 
(a) 0,2 mL/phút (b) 0,3 mL/phút 
(c) 0,4 mL/phút (d) 0,5 mL/phút 
Hình 3.37. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các tốc độ dòng khảo sát 
Bảng 3.54. Thông số sắc ký của hỗn hợp chuẩn tương ứng với tốc độ dòng 
F 
(mL/phút) 
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic Hệ số bất đối 
PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ 
0,2 7,16 6,25 9,15 4,10 4228424 1002493 4066669 2241248 1,00 1,09 1,22 1,14 
0,3 6,58 5,91 8,59 3,83 4222905 1087353 3918298 2135246 1,05 1,11 1,03 1,10 
0,4 5,88 5,28 7,96 3,15 3772178 892150 3595601 1765313 1,16 1,13 1,25 1,15 
0,5 5,52 4,81 7,52 2,98 3531225 857693 3212482 1589331 1,10 1,14 1,00 1,06 
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
(a) Nhiệt độ cột 30 oC (b) Nhiệt độ cột 35 oC 
(c) Nhiệt độ cột 40 oC (d) Nhiệt độ cột 45 oC 
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
325000
350000
375000
400000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
D
ia
ze
p
am
108 
Nhận xét: Khi tốc độ dòng tăng, các pic xuất hiện sớm nhưng tín hiệu giảm. 
Do đó, tốc độ dòng 0,3 mL/phút được lựa chọn vì cho tín hiệu các chất phân tích cao 
hơn so với tốc độ dòng 0,4 và 0,5 mL/phút; đồng thời thời gian phân tích ngắn hơn 
so với tốc độ dòng 0,2 mL/phút. 
Khảo sát thể tích tiêm: Kết quả trình bày ở Bảng 3.55 và Hình 3.38. 
(a) Thể tích tiêm 2 µL (b) Thể tích tiêm 5 µL 
Hình 3.38. Sắc ký đồ tương ứng với các thể tích tiêm khảo sát 
Bảng 3.55. Thông số sắc ký của chất phân tích, chuẩn nội với thể tích tiêm khảo sát 
V 
(L) 
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic Hệ số bất đối 
PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ 
2 6,59 5,90 8,59 3,82 8928255 2656459 8422133 3612521 1,15 1,26 1,15 1,24 
5 6,58 5,91 8,59 3,83 4223155 1163266 4091425 1912346 1,07 1,10 1,05 1,09 
Nhận xét: Khi thể tích tiêm tăng từ 2 µL lên 5 µL, tín hiệu (diện tích pic) tăng 
cao. Tuy nhiên, khi thể tích tiêm 5 µL thì các pic bị dãn, chiều rộng pic tăng. Điều 
này dẫn tới khả năng lấy tích phân sắc ký đồ không chính xác. Do vậy, thể tích tiêm 
2 µL là phù hợp. 
Từ các kết quả khảo sát, điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời 3 
lignan phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin trong huyết tương thỏ là: Pha động: 
Methanol – dung dịch đệm amoni format 5 mM (63 : 37). Cột sắc ký: Gemini C18 
(100 2 mm; 3 µm). Nhiệt độ cột: 40 oC. Nhiệt độ autosampler: 5 oC. Tốc độ dòng: 
0,3 mL/phút. Thể tích tiêm: 2 µL. Phát hiện: Đầu dò khối phổ MRM, ESI (+). 
3.4.1.4. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 
Phương pháp tủa protein: Hiệu suất chiết (H %) được trình bày trong Bảng 
3.56. 
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp xử lý mẫu bằng cách tủa 
protein cho hiệu suất chiết của hypophyllanthin lớn hơn 110 %. Điều này chứng tỏ 
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
D
ia
ze
p
am
P
h
y
ll
an
th
in
D
ia
ze
p
am
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
H
y
p
o
p
h
y
ll
an
th
in
N
ir
an
th
in
P
h
y
ll
an
th
in
109 
phương pháp tủa gây nên sự ảnh hưởng nền mẫu (matrix effect) theo kiểu tăng cường 
ion (ion enhancement). Do vậy, phương pháp tủa không phù hợp để xử lý mẫu. 
Bảng 3.56. Hiệu suất chiết các chất từ huyết tương thỏ với 2 dung môi tủa (n = 6) 
Mẫu 
H % – Tủa với methanol H % - Tủa với acetonitril 
PLT HPL NRT DAZ PLT HPL NRT DAZ 
1 109,49 135,62 118,95 111,18 92,66 126,11 99,00 95,60 
2 109,00 129,36 112,70 108,02 97,72 130,48 99,04 90,23 
3 106,82 123,99 116,72 111,35 100,96 133,93 97,70 96,29 
4 110,82 129,07 118,20 106,26 91,28 126,09 96,93 93,98 
5 104,70 129,91 108,37 106,04 95,81 129,09 98,09 86,78 
6 100,70 136,91 128,37 110,04 101,49 119,13 93,82 93,66 
TB 106,92 130,81 117,22 108,81 96,65 127,47 97,43 92,76 
RSD 
% 
3,50 3,63 5,75 2,19 4,36 3,95 1,99 3,89 
 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 
Khảo sát dung môi chiết: Kết quả khảo sát dung môi chiết đư